声敏型脂质纳米粒联合低功率聚焦超声对HepG2细胞增殖的影响及其体外CT成像的实验研究

目的制备一种载血卟啉单甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether,HMME)包裹全氟溴辛烷(1-Bromoheptadecafluorooctane,PFOB)及阿霉素(doxorubicin,DOX)的声敏型脂质纳米粒(sound sensitive nano-liposomes,SNLs),探究其联合低功率聚焦超声(low intensity focused ultrasound,LIFU)体外释药、产生活性氧的能力以及对HepG2细胞增殖的影响,和其体外CT成像的能力。方法采用薄膜水化法制备SNL;检测其一般性质;高效液相色谱法检测其体外释药;荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜观察其产生活性氧的能力; CCK-8实验检测其对HepG2细胞增殖的影响,CT观察其体外CT成像。结果成功制备SNL,粒径为(282. 53±6. 95) nm; LIFU处理8h内SNL释放阿霉素达(83. 45±2. 97)%,释药速度随LIFU强度提高而加快;以DPBF(1,3-二苯基异苯并呋喃)为活性氧探针,产生活性氧的相对量随SNL中血卟啉单甲醚增加及LIFU强度增高而增多;以DCFH-DA(2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐)为活性氧探针,激光共聚焦观察显示SNL+LIFU组较SNL组绿色荧光强; CCK-8检测结果显示SNL+LIFU组的细胞存活率明显较DOX组,载血卟啉单甲醚包裹全氟溴辛烷的脂质纳米粒(hematoporphyrin monomethyl ether nano-liposomes,HNL)+LIFU组和SNL组低(P <0. 05),可见SNL+LIFU明显增强了对HepG2细胞生长的抑制作用; CT成像结果显示SNL的CT值较对照组和空白组高,且CT值随PFOB浓度增大而增高。结论成功制备的声敏型脂质纳米粒的声动力效果呈HMME浓度及LIFU强度依赖性,药物释放速度受LIFU控制,可联合化疗及声动力治疗增强HepG2细胞生长的抑制效果,同时具有良好的CT成像效果。

靶向肿瘤细胞的相变型纳米粒多模态显像及其声动力治疗的体外实验研究

目的制备一种具有肿瘤靶向性的相变型多功能脂质纳米粒,探讨该纳米粒的体外多模态显像、寻靶和声动力治疗效果。方法采用乳化法制备包载IR780及全氟戊烷(PFP)的脂质纳米粒(Lip-PFP-IR780),检测纳米粒的基本特性。通过体外超声、光声、荧光成像评价多模态显像效果,通过共聚焦和流式细胞术评价其对4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)的寻靶能力,通过单线态氧(SOSG)检测法和细胞计数试剂盒(CCK-8法)评价其声动力治疗效果。结果制备的纳米粒大小均一,粒径为(338.5±124.2)nm,电位为(–27.6±2.4)mV,包封率为91.6%。纳米粒经低强度聚焦超声(LIFU)辐照相变后可用于超声造影显像;光声信号值呈浓度依赖性;荧光显像效果明显。4T1细胞对靶向纳米粒的结合率明显高于非靶向纳米粒(P<0.05)。纳米粒经LIFU辐照后,可以产生单线态氧,通过声动力杀伤肿瘤细胞,LIFU辐照组与未辐照组比较细胞存活率明显下降(P<0.05)。结论成功制备了靶向肿瘤细胞的相变型纳米粒Lip-PFP-IR780,能够进行多模态显像及声动力治疗。

载单宁酸铁和紫杉醇相变型纳米粒用于体外超声显像及治疗视网膜母细胞瘤

目的制备可用于早期诊断和治疗视网膜母细胞瘤(Rb)的纳米粒,体外评价其超声显像和治疗效果。方法制备载单宁酸铁(FeⅢTA)和紫杉醇(PTX)并包裹全氟戊烷(PFP)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒,检测其粒径、电位、电镜、吸光度、包封率、载药量等相关表征,评估808激光(1 W/cm 2,5 min)辐照前后温度变化和超声信号改变,光镜下观察纳米粒相变情况。体外检测FeⅢTA/PLGA/PFP纳米粒的生物安全性。设立空白对照组、激光组、FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP(FPTP)组、FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP+激光(FPTP+激光)组及不同浓度(0、0.250、0.500、1.000 g/L)FPTP+激光组,检测激光辐照5 min后各纳米粒组对肿瘤细胞的杀伤效果。结果成功制备出FeⅢTA/PLGA/PTX/PFP纳米粒,粒径(155.8±55.68)nm,电位(-27.3±5.14)mV,透射电子显微镜下见黑色FeⅢTA外壳包裹核心灰白球形结构,PTX包封率(70.89±8.03)%,载药率(9.61±0.63)%。体外激光辐照FPTP纳米粒后温度上升与浓度呈正相关,B模式和造影模式超声信号也随浓度增加而增强。FPTP+激光组对Y79细胞的杀伤作用比空白对照组、激光组、FPTP组更强,并随浓度增加而增强。结论成功制备出载单宁酸铁和紫杉醇的相变型纳米粒,具有良好的光热效应和超声显像效果,对Y79细胞有强杀伤作用,有望用于Rb实现诊疗一体。

超声介导携氧载紫杉醇微泡对乏氧巨噬细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨超声介导携氧载紫杉醇脂质微泡对乏氧巨噬细胞增殖和凋亡的影响。方法筛选超声辐照小鼠巨噬细胞RAW264.7合适的超声参数,用Co Cl2诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7乏氧模型,将乏氧巨噬细胞随机分为对照组(controlgroup)、紫杉醇组(PTX group)、甲氨蝶呤组(MTX group)、超声组(US group)、携氧脂质微泡组(OMBs group)、携氧载紫杉醇脂质微泡组(OPLMBs group)和超声介导携氧载紫杉醇脂质微泡组(OPLMBs+US group),分别进行干预。采用MTT法检测各处理组巨噬细胞增殖,Annexin V-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡。结果超声强度为0.5 W/cm2,连续作用30 s时细胞存活率为(95.85±2.36)%。超声介导携氧载紫杉醇脂质微泡组增殖抑制率及凋亡率分别为(46.01±2.35)%和(27.64±1.36)%,明显高于其它各处理组(P<0.05)。结论超声介导携氧载紫杉醇脂质微泡能明显抑制乏氧巨噬细胞的增殖、诱导其凋亡,可为RA体内实验研究提供思路。

制备多模态成像对比剂并用于联合治疗葡萄膜黑色素瘤:体外实验

目的制备肿瘤微环境响应性超声/MRI/光学成像纳米粒(Ce6@TA-Fe),观察其性能、体外多模态成像及光热联合氧气增强光动力治疗体外葡萄膜黑色素瘤(UM)的效果。方法以Ce6、单宁酸(TA)及FeCl_(3)·6H_(2)O制备Ce6@TA-Fe纳米粒,检测其理化性质,观察其体外多模态显像效果,评估光热联合光动力治疗对UM细胞(C918)的体外杀伤作用。结果成功制备载Ce6和Fe^(3+)的纳米探针(Ce6@TA-Fe),平均粒径(26.51±5.91)nm,电位(-21.5±6.45)mV。体外成像实验证实,Ce6@TA-Fe浓度越高,成像效果越好。激光照射后Ce6@TA-Fe迅速升温,并产生活性氧。Ce6@TA-Fe与C918细胞孵育并经激光辐照后,C918细胞存活率仅(5.71±2.71)%,提示其具有体外杀伤UM细胞能力。结论所制备Ce6@TA-Fe纳米粒具备体外多模态显像及在联合治疗中杀伤UM细胞的能力。

剪切波弹性成像监控离体猪肝组织温度变化的实验研究

目的应用剪切波弹性成像(SWE)监控离体猪肝组织硬度值随温度变化情况,探讨SWE在监控光热治疗中的作用。方法以水浴法对新鲜离体猪肝进行加热。应用SWE检测肝组织自35℃升温至85℃时的组织硬度值,以及肝组织维持一定温度10 min前、后组织硬度值变化;并与病理组织学进行对照分析。结果40℃~50℃时肝组织硬度值分别与35℃时比较差异均无统计学意义;55℃~85℃时肝组织硬度值分别与35℃组比较差异均有统计学意义(均P<0.05);35℃~50℃肝组织硬度值两两比较差异均无统计学意义;55℃~85℃肝组织硬度值分别与35℃~50℃时两两比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。肝组织病理图显示,随温度升高肝窦变窄,细胞逐渐水肿直至破裂。50℃~85℃时肝组织硬度值与连续升温实验中对应温度比较差异均无统计学意义;50℃~85℃时肝组织维持温度10 min前、后组织硬度值比较差异均无统计学意义;85℃时肝组织维持温度恒定10 min前、后组织硬度值比较差异有统计学意义[(119.31±2.91)kPa vs.(158.64±1.49)kPa,P<0.05]。肝组织病理图显示,50℃~85℃维持温度10 min前、后肝组织无明显变化。结论应用SWE可精确评价光热治疗时离体猪肝组织硬度随温度变化情况。

靶向抗ICAM-1的载伊马替尼和液态氟碳脂质体对内毒素诱导的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征模型小鼠的治疗研究

目的探讨靶向抗细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)的载伊马替尼(imatinib mesylate,IM)和液态氟碳(liquid fluorocarbon,LF)脂质体对内毒素(lipopolysaccharides,LPS)诱导的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS)模型小鼠的治疗效果。方法用旋转蒸发法制备靶向抗ICAM-1的载伊马替尼和液态氟碳脂质体,用马尔文粒径仪器检测其粒径,透射电镜下观察脂质体内部载药情况。光镜下观察其形态,置于37.5℃恒温加热板上观察其相变情况。体外模拟体内药物释放环境,观察脂质体内包载的伊马替尼药物的释放。6~8周大小30只C57BL/6小鼠按随机数字表法分为:对照组,LPS造模组,靶向抗ICAM-1脂质体治疗组,每组10只。治疗结束1 d后观察肺石蜡切片HE染色和肺石蜡切片免疫荧光ICAM-1的分布情况,肺组织提取mRNA,用qRT-PCR检测IL-6,IL-8,IL-10,TNF-α表达情况,同时对比肺的病理切片,小鼠肺湿干重比和小鼠肺泡液体清除率。靶向抗ICAM-1脂质体和非靶向脂质体分别尾静脉注射入ALI/ARDS小鼠体内,各个器官做冰冻切片,共聚焦激光显微镜下观察两组脂质体在小鼠体内各个器官的分布。结果成功制备靶向抗ICAM-1的载伊马替尼和液态氟碳脂质体,其粒径为(320.8±58.7)nm,透射电镜下观察其内部成功包载药物,光镜下看到脂质体大小均匀,在37.5℃恒温板发生相变形成微泡。12 h脂质体药物释放达到高峰,绘出脂质体药物的释放曲线。与对照组相比,LPS造模组有典型的ALI/ARDS病理特征,肺损伤明显,病理切片评分增加(P<0.01),炎症因子IL-6,IL-8,TNF-α增加(P<0.01),IL-10减少(P<0.05)。湿干重比(W/D)增高(P<0.01),而小鼠肺泡液体清除率(alveolar fluid clearance,AFC)明显减弱(P<0.01)。靶向抗ICAM-1脂质体治疗组肺损伤减缓,病理切片评分下降(P<0.05),炎症因子IL-6,IL-8,TNF-α减少(P<0.05),IL-10增加(P<0.05)。肺湿干重比下降(P<0.05),而小鼠肺泡液体清除率好转(P<0.05)。结论靶向抗ICAM-1载伊马替尼和液态氟碳脂质体对LPS诱导的小鼠ALI/ARDS有明显的治疗作用。

载GOD/Fe3O4的PLGA纳米粒子对视网膜母细胞瘤疗效的体外研究

目的探讨一种新型的包裹葡萄糖氧化酶(GOD)/超顺磁性四氧化三铁纳米粒(Fe3O4Nps)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒子对视网膜母细胞瘤(RB)体外治疗的效果。方法利用双乳化法制备包裹GOD/Fe3O4的PLGA纳米粒子,对其粒径大小、电位、外部形态和内部结构等相关表征进行检测。依据包含的不同纳米粒子设立空白对照组、Fe3O4/PLGA(PF)组、GOD/PLGA(PG)组、GOD/Fe3O4/PLGA(PFG)组;设立不同浓度(0、0.0625、0.125、0.25μg/ml)的PFG纳米粒子组,以验证其毒性作用。检测不同纳米粒子组与Y79细胞共孵育后对Y79细胞的毒性作用、存活情况及活性氧产生情况。结果成功制备出包裹了GOD/Fe3O4的PLGA纳米粒子,其平均粒径为299.3 nm,形态均一呈圆形。纳米粒子与Y79细胞共孵育后被Y79细胞吞噬,产生大量活性氧;细胞毒性实验结果显示,PFG组Y79细胞存活率[(53.648±2.565)%]明显低于空白对照组[(100.028±4.491)%]、PF组[(97.782±17.520)%]、PG组[(87.438±3.537)%](F=21.226,P<0.01);0.25μg/ml的PFG纳米粒子组Y79细胞存活率[(51.770±1.529)%]明显低于对照组[(100.000±5.021)%]、0.0625μg/ml组[(85.723±6.903)%]、0.125μg/ml组[(74.535±8.282)%](F=34.593,P<0.01)。激光共聚焦显微镜下观察,结果显示PFG组Y79细胞大量死亡。结论成功制备了包裹GOD/Fe3O4的新型PLGA纳米粒子;该纳米粒子具有良好的活性氧产生能力,能杀死Y79肿瘤细胞,有望成为一种治疗RB的新方法。

抗PECAM-1靶向载药纳米脂质体对小鼠机械通气诱导肺损伤模型的预防作用初探

目的:探究抗PECAM-1靶向载伊马替尼(imatinib,IM)的纳米脂质体对机械通气诱导肺损伤(mechanical ventilator-induced lung injury,VILI)的小鼠模型的预防作用效果。方法:采用旋转蒸发法制备抗PECAM-1的靶向载伊马替尼的纳米脂质体(targeting imatinib-loaded nanoliposomes,IM-lip),用Malvern粒度仪测定其平均粒径和电位,透射电镜下观察其包药,光镜下观察形态及相变释放药物,荧光显微镜观察其连靶。将小鼠随机分为4组:正常组、VILI组、伊马替尼作用机械通气组(IM+VILI组)、靶向载药纳米脂质体作用机械通气组(IM-lip+VILI组)。通气前,VILI组尾静脉注射100μL PBS,IM+VILI组腹腔注射伊马替尼(1.5 mg/20 g),IM-lip+VILI组尾静脉注射100μL靶向纳米脂质体(约1.57 mg/100μL)。3 h后收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),测定总蛋白和中性粒细胞计数,酶联免疫吸附法测定BALF中白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的含量,测定肺组织湿重/干重(W/D)值,肺组织石蜡切片苏木素-伊红(HE)染色观察病理情况,取IM-lip+VILI组小鼠肺组织做冰冻切片观察脂质体在肺内的靶向定位。结果:靶向载药纳米脂质体的粒径为(302.00±26.31)nm,电位为(-4.22±1.20)m V,包封率为(84.15±2.35)%。激光共聚焦显微镜下观察其在肺内定位,显示脂质体连靶成功。与正常组相比,VILI组的病理切片有典型的肺损伤特点,病理评分明显升高(P=0.000),W/D值增加(P=0.000),BALF中总蛋白、中性粒细胞数量、IL-6、IL-8、TNF-α含量明显上升(P=0.000);与VILI组相比,IM+VILI组肺组织损伤评分降低(P=0.000),W/D值下降(P=0.000),BALF中总蛋白、中性粒细胞数量、IL-6、IL-8、TNF-α含量减少(P=0.000);与IM+VILI组相比,IM-lip+VILI组肺组织损伤评分降低(P=0.000),肺W/D值下降(P=0.000),BALF中总蛋白、中性粒细胞数量、IL-6、IL-8、TNF-α含量明显减少(P=0.000)。结论:靶向载药纳米脂质体能有效到达肺组织,通过抑制炎症反应减轻机械通气诱导肺损伤。

氧化铱纳米载药复合物的制备及其用于肿瘤声动力-化疗协同治疗的研究

目的制备氧化铱(iridium oxide,IrO_(X))作为纳米声敏剂,用以负载化疗药物阿霉素(doxorubicin,DOX)后得到具有pH和超声辐照双响应的纳米载药复合物(IrO_(X)@DOX),验证其用于肿瘤声动力治疗(sonodynamic therapy,SDT)-化疗协同治疗肿瘤的效果。方法采用热水解法制备IrO_(X)纳米颗粒,并负载DOX。采用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)、X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)、紫外-可见分光光度计(ultraviolet-visible spectrophotometer,UVvis)、Zeta电位分析仪等手段对纳米颗粒的形貌及理化性质进行相关表征;采用UV-Vis和酶标仪考察载药量及药物释放行为;用电子顺磁共振波谱仪(lectron spin-resonance spectroscopy,ESR)定性评价其活性氧产生性能;激光共聚焦显微镜评价IrO_(X)@DOX在超声辐照下的细胞摄取行为;荧光显微镜和流式细胞仪探究细胞内活性氧产生;CCK-8法及流式凋亡检测评价IrO_(X)@DOX的声动力治疗-化疗协同治疗效果。建立Hepa1-6肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,并分为生理盐水组、IrO_(X)组、IrO_(X)+US组、IrO_(X)@DOX组、IrO_(X)@DOX+US组(n=3),观察各组荷瘤鼠肿瘤的体积、超声造影成像结果与病理学变化,计算肿瘤体积抑制率评价其体内协同治疗效果。结果成功制备IrO_(X)纳米颗粒,粒径大约为5 nm。当IrO_(X)与DOX的比值为4.0时,载药量可达18.7%;IrO_(X)@DOX在p H=7.4时释放的DOX量不足10%,证实了其良好的稳定性;pH=5.5时,DOX的累积释放量可达39.9%。在超声辐照下释放量进一步增加达69.9%;ESR和UV-Vis实验结果表明活性氧产量与辐照功率和时间呈正相关;激光共聚焦结果显示超声能促进细胞对IrO_(X)@DOX的摄取;细胞毒性实验表明,与单纯化疗组相比,协同治疗组存活率降至19.4%,证明IrO_(X)@DOX在超声辐照下可以实现良好的SDT-化疗协同治疗效果。动物实验表明与生理盐水组相比,IrO_(X)+US组、IrO_(X)@DOX组和IrO_(X)@DOX+US组的肿瘤抑制率分别为27%、57%及76%,差异具有统计学意义(P<0.05)。这与超声造影和HE染色结果一致。结论成功制备了具有pH和超声辐照双重刺激响应的IrO_(X)@DOX纳米复合物,在超声辐照下可以实现SDT-化疗协同治疗。