沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株的建立及其生物学特性的研究

B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1(B-cell-specific moloney murine leukemia virus insertionsite 1,Bmi-1)基因是多梳基因家族成员,参与细胞增殖调控.研究发现Bmi-1基因可能参与肿瘤的形成,可能成为肿瘤潜在的治疗靶点.用RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默Bmi-1基因表达观察其对乳腺癌细胞株MCF-7侵袭和转移等生物学特性的影响,以探讨Bmi-1在乳腺癌发生发展中的作用.PT67细胞包装质粒后产生的逆转录病毒感染MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选建立稳定细胞株,稳定抑制Bmi-1的细胞株命名为MCF-7/Bmi-1si.通过RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Bmi-1的表达量;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭和转移能力.MCF-7/Bmi-1si组与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,Bmi-1 mRNA和蛋白表达量明显减少,克隆形成数及形成率也明显减少(P<0.05).侵袭和转移实验表明:与MCF-7和MCF-7/GFPsi组相比,MCF-7/Bmi-1si组细胞在Transwell侵袭小室中24 h穿膜细胞数明显减少(P<0.05).结果表明沉默Bmi-1基因表达稳定细胞株构建成功,Bmi-1基因表达的沉默能显著降低MCF-7细胞的体外增殖及侵袭转移能力.

逆转录病毒载体介导的RNAi抑制Bmi-1基因表达对MCF-7细胞的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)抑制Bmi-1基因表达后对乳腺癌细胞株MCF-7凋亡和增殖的影响.方法:将表达Bmi-1短发夹RNA(shRNA)的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si瞬时转染MCF-7乳腺癌细胞株,携带针对绿色荧光蛋白干扰序列的载体pSuper-retro/GFPsi作为阴性对照.用RT-PCR和Western Blot分别从mRNA,蛋白水平检测Bmi-1的表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测MCF-7细胞周期和凋亡的变化.结果:pSuper-retro/Bmi-1si明显抑制MCF-7细胞Bmi-1 mRNA及蛋白表达.与空白对照组及阴性对照组相比较凋亡细胞数无明显增加;抑制Bmi-1基因表达使MCF-7细胞G1/S周期转换及细胞增殖速率受抑制.结论:表达shRNA的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si能显著抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Bmi-1基因表达,从而有效抑制MCF-7细胞增殖,为乳腺癌的基因治疗提供了实验依据.

沉默Bmi-1基因表达对MCF-7细胞阿霉素敏感性的影响

目的研究Bmi-1对MCF-7细胞阿霉素敏感性的影响及机制。方法阿霉素处理MCF-7／Bmilsi、MCF-7／GFPsi和MCF一7细胞株，M1Tr法检测阿霉素的IC50；DAPI检测阿霉素处理后细胞的凋亡，计算凋亡指数（apoptosisindex，AI）；Western印迹检测相关蛋白P53，phospho—Akt（Ser473）（pAkt），totle—Akt（tAkt），Bcl-2，Bax的表达。结果阿霉素处理72h的MCF-7／Bmi．1si组生长抑制率明显高于MCF-7和MCF-7／GFPsi组，MCF-7／Bmilsi组的IC50为（0．15±0．02）μg／ml，而MCF-7组和MCF-7／GFPsi组的IC50分别为（0．87±0．06）μg/ml和（0．81±0．02）μg/ml（P〈0．05）。阿霉素处理48h后用DAPI检测凋亡发现，MCF-7／Bmi．lsi＋doxorubiein组可见大量凋亡细胞，而MCF-7＋doxorubicin和MCF-7／GFPsi＋doxo—rubicin组出现较少的凋亡细胞，MCF-7／Bmi-1si＋doxorubicin组凋亡指数明显高于对照组（P〈0．05）。进一步研究发现：MCF-7／Bmi．1si＋doxorubicin组与MCF-7＋doxorubiein及MCF-7／GFPsi＋doxorubiein组相比，P53表达量增加，tAkt表达未发生改变，而pAkt的表达明显减少，另外，Bcl-2表达量减少而Bax表达量增加，差异具有显著性（P〈0．05）。结论沉默Bmi—l基因表达能增加MCF-7细胞对阿霉素的敏感性，增加阿霉素引起的凋亡。