隐睾发生过程中DNA甲基化状态和甲基化转移酶表达的实验研究

目的研究环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二（2-乙基已基）酯[Di—（2-ethylhexy）phthalate，DEHP]作用于孕鼠后，胎鼠睾丸组织基因组DNA甲基化水平的变化及3种DNA甲基化转移酶的表达情况；探讨DEHP所致表观遗传修饰改变在睾丸下降过程中的作用。方法妊娠昆明小鼠（KMmice）随机分为3组，即正常对照组、玉米油对照组和DEHP实验组，每组15只。玉米油对照组和DEHP实验组自妊娠第12．5天到妊娠第18．5天分别持续经口予以玉米油和DEHP，用量按每日500mg／kg，正常对照组不予灌药。采用高效液相色谱仪检测基因组DNA甲基化水平，实时荧光定量PCR检测3种DNA甲基化转移酶的表达量。结果正常对照组和玉米油对照组DNA甲基化水平和3种甲基化转移酶的表达均无统计学意义（P〉0．05）：DEHP实验组DNA甲基化水平比对照组增高约10％。与对照组相比，差异有显著统计学意义（P〈0．05）；实验组3种甲基化转移酶的表达量均比对照组高，与对照组相比，差异有显著统计学意义（Dnmt1，P〈0．05；Dnmt3a，P〈0．01；Dnmt3b，P〈0．05）。结论环境内分泌干扰物DEHP通过影响3种甲基化转移酶的表达而导致基因组DNA甲基化水平升高，从而抑制睾丸下降过程中多种基因的表达，发生隐睾。DNA甲基化等表观遗传学修饰的改变可能是DEHP诱发隐睾的分子机制之一。

邻苯二甲酸二(2-乙己基)酯致小鼠睾丸基因组DNA甲基化水平变化分析

目的:探讨增塑剂邻苯二甲酸二(2-乙己基)酯(DEHP)作用于怀孕小鼠后,其仔代睾丸基因组DNA甲基化水平的改变情况。方法:妊娠KM小鼠随机分为3组:正常对照组、玉米油对照组和DEHP实验组。自妊娠12.5 d到生后第3天分别持续经口予以玉米油和DEHP[500 mg/(kg.d)],于生后第7天取仔代睾丸,应用甲基敏感扩增多态性(MSAP)技术,对仔鼠睾丸组织DNA进行EcoRⅠ/MspⅠ和EcoRⅠ/HpaⅡ两种酶切反应,经ABI 3730DNA自动测序仪电泳及检测后,运用Genescan3.1分析扩增谱带。结果:对CCGG位点,DEHP实验组小鼠仔代睾丸组织DNA甲基化程度明显增高,其甲基化水平为(34.03±3.05)%;而正常对照组和玉米油对照组小鼠仔代睾丸组织基因组DNA甲基化程度分别为(28.37±2.37)%和(28.58±2.45)%。DEHP实验组与正常对照组和玉米油对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:DEHP作用孕鼠后可导致仔代睾丸基因组DNA甲基化水平改变,影响基因组表观遗传修饰改变,可能是导致生殖系统损害的重要毒理机制之一。

同种异体骨髓间充质干细胞移植对扩张型心肌病模型兔心功能与结构及电生理的影响(英文)

背景：近年来通过细胞移植修复扩张型心肌病受损心肌、提高心功能已成为研究热点，但细胞移植后对心脏电生理的影响仍有待观察。目的：观察同种异体体内移植骨髓间充质干细胞移植后对扩张型心肌病模型兔心功能、结构及电生理的影响。设计，时间及地点：随机对照动物实验。于2004-01／2006—05在重庆医科大学附属儿科研究所电生理实验室完成。材料：选用43只新西兰白兔，体质量3．0～3．5kg，雌雄不拘。阿霉素为浙江海正医药公司产品，生产批号为050307。SSD-5000超声诊断仪为日本Aloka生产，RM6240多导电生理记录仪为成都仪器厂生产。方法：①摸球法将实验兔随机分为正常组（n=12），细胞移植组（n=13），模型组（n=13），后两组实验兔参考Amoda等的方法采用阿霉素诱导扩张型心肌病模型，每次1mg／kg，每周2次，连续8周，正常组不造模。获取剩余5只实验兔骨髓原液，用贴壁筛选法分离、扩增、纯化骨髓间充质干细胞。②细胞移植组及模型组模型建立成功后3周暴露心脏，将细胞分4点注射到左室前壁，模型组于相同条件下注射等体积DMEM／F12培养基。正常对照组在相同条件下不注射任何药品。主要观察指标：移植后4周，①采用超声诊断仪检测3组大鼠左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室射血分数、左室短轴缩短率等心功能指标。②应用多导电生理记录仪检测大鼠心肌单相动作电位振幅、0相上升的最大速率、单相动作电位时程从激动开始至复极完成50％及90％的时间，记为MAPD50及MAPD90。③取细胞移植组移植区心肌及模型组心肌标本，行透射电镜及光镜下组织学观察，同时进行植入细胞肌钙蛋白T和缝隙连接蛋白43的免疫荧光检测。结果：纳入实验兔43只，细胞移植组中各有9只因阿霉素急、慢性毒性作用以及手术后感染原因死亡，其余25只均进入结果分析。①心功能检测结果：细胞移植组实验兔左室收缩末期内径较模型组减小，左室射血分数、左室短轴缩短率均高于模型组，差异有统计学意义（P〈0．05）。②心电生理检测结果：细胞移植组实验兔MAPD50、MAPD90短于模型组，差异有统计学意义（P〈0．05）。③心肌组织学观察：模型组可见心肌细胞呈广泛的水肿和显著的空泡变性改变，电镜示心肌细胞线粒体肿胀，增生，肌节长短不一，出现异常收缩带，可见局部心肌溶解，细胞移植组移植区组织与之相比，各种受损表现较轻，且移植细胞有肌钙蛋白T和缝隙连接蛋白43的表达。结论：同种异体体内移植骨髓间充质干细胞后在一定程度上可改善扩张型心肌病模型兔心功能，减轻病理损害，并可能抑制心电紊乱的进一步发展。

大鼠体外循环模型的建立及改进

目的对现有大鼠体外循环模型予以改进,降低模型复制难度,并使之更适合用于研究体外循环对肺功能的影响。方法成年雄性SD大鼠16只,体重300～350g,各8只分别用于建模和供血。经右颈静脉、左股静脉引流,右股动脉人工灌注建立体外循环,血气分析监测内环境变化。实验过程中,保留大鼠自主呼吸,不进行机械通气。结果成功建成8只大鼠体外循环模型并按计划顺利脱离人工循环。体外循环期间转流量为70～80mL/(kg.min),血流动力学监测和血气分析结果基本正常。结论进一步简化了建立大鼠体外循环模型的操作,最显著的改进之处在于避免了机械通气对大鼠肺功能潜在的不良效应,从而更加适合用于研究体外循环对肺功能的影响。

胰岛素样因子3在邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯诱导隐睾发生过程中的表达分析

目的:研究环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二(2-乙已基)酯(Di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)作用于孕鼠后,其胎鼠睾丸组织中胰岛素样因子3(Insulin like factor3,INSL3)mRNA和蛋白质的表达情况;探讨DEHP诱发小鼠隐睾的分子机制.方法:妊娠KM小鼠随机分为3组:正常对照组、玉米油对照组和DEHP实验组.玉米油对照组和DEHP实验组自妊娠12.5d到妊娠18d分别持续经口予以玉米油和DEHP500mg/(kg.d),正常对照组不予灌药.结果:正常对照组和玉米油对照组睾丸组织中INSL3 mRNA和蛋白质的表达均无差异(P>0.05);DEHP实验组INSL3 mRNA的表达量约为对照组的1/3,与对照组相比其差异具有显著性(P<0.05);实验组INSL3蛋白质的表达量约为对照组的1/4,与对照组相比其差异具有显著性(P<0.05).结论:环境内分泌干扰物DEHP下调睾丸间质细胞INSL3 mRNA和蛋白质的表达,影响睾丸引带发育,可能是DEHP诱发隐睾的分子机制之一.

SFRP5抑制BMP9诱导人脐带间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的：探讨脂肪因子分泌型卷曲相关蛋白（secreted frizzled-related protein 5,SFRP5）对骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）成骨分化的影响。方法：将人脐带间充质干细胞根据不同的处理因素分为4组：对照组、BMP9组、BMP9＋SFRP5组和SFRP5组;分别在3天、5天和7天进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性读数,7天进行ALP染色,21天进行茜素红染色检测钙盐沉积及油红O染色;收集不同组的细胞用于裸鼠皮下注射成骨模型的建立,4周后取出离体骨进行Micro-CT扫描和分析,获取的标本进行HE、Masson染色,Alcian blue染色及油红O染色检测。Western blot检测成骨分化相关蛋白Runx2和OPN的表达。结果：BMP9组的ALP活性读数和染色结果和茜素红染色结果均较对照组增加,而BMP9＋SFRP5组则较BMP9组降低;BMP9处理后出现少量脂滴,而BMP9＋SFRP5组脂滴明显增加,SFRP5组脂滴最多;裸鼠皮下注射成骨模型的观察结果显示,对照组和SFRP5组没有形成肉眼可见的皮下包块,BMP9组和BMP9＋SFRP5组能生成异位骨;4周后观测大体标本以及进行MicroCT检测,发现BMP9＋SFRP5组的骨密度值小于BMP9组（P〈0.05）。HE、Masson染色,Alcian blue染色结果显示,BMP9组的骨分化程度大于BMP9＋SFRP5,油红O染色结果示BMP9＋SFRP5组有较多的成脂分化;SFRP5能抑制BMP9诱导的Runx2、OPN的蛋白质表达。结论：SFRP5抑制BMP9诱导的人脐带间充质干细胞成骨分化。

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯致胎鼠隐睾发生过程中胰岛素样因子3的表达分析

目的:探讨环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯[Di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]诱发胎鼠隐睾的分子机制。方法:妊娠昆明小鼠随机分为3组,每组15只:DEHP实验组(A组)、玉米油(溶剂)对照组(B组)和正常对照组(C组)。A组和B组自妊娠12.5￣18.5d分别持续经口每天给予DEHP(500mg/kg)或玉米油,C组不予灌药。结果:B组和C组睾丸组织中胰岛素样因子3(INSL3)mRNA和蛋白质的表达均无差异(P>0.05);A组INSL3mRNA的表达量约为B或C组的1/3,INSL3蛋白质的表达量约为B或C组的1/4,与B或C组比其差异显著(P<0.05)。A组睾丸引带发育不良,睾丸位置异常。结论:环境内分泌干扰物DEHP下调睾丸间质细胞INSL3基因的表达,影响睾丸引带发育,可能是DEHP诱发隐睾的分子机制之一。