儿童原发性免疫缺陷病患者EBV转化的B淋巴母细胞系的建立及应用

目的:建立原发性免疫缺陷病人外周血永生化B细胞系,保存原发性免疫缺陷病人特有的基因组资源,为进一步研究原发性免疫缺陷病提供丰富实验材料。方法:采用密度梯度离心法分离PBMC,加入环孢菌素A、EB病毒共培养以转化外周血淋巴细胞。结果:成功建立14例原发性免疫缺陷病人外周血永生化B细胞系,建株成功率100%;对已建立的永生细胞株冻存和复苏,成功率为100%;转化前后制备细胞染色体和G显带核型分析无明显改变。结论:经EB病毒成功转化外周血B淋巴细胞为永生细胞株,为进一步开展原发性免疫缺陷病的基础研究提供了资料。

STAT3基因多态性与重庆地区汉族儿童川崎病易感性的关系

目的探讨信号转导和转录激活因子-3(signal transducer and activator of transcription-3,STAT3)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与重庆地区汉族儿童川崎病(kawasaki disease,KD)易感性的关系。方法用序列特异性引物聚合酶链反应(sequence specific primers-polymerase chain reaction,SSP-PCR)分析130例重庆地区汉族川崎病患儿及147名健康儿童STAT3基因内含子11(rs2293152C/G和rs957970C/T)的SNP,统计学分析病例组与对照组之间的差异。结果川崎病组STAT3基因rs2293152C/G位点CC基因型频率(23.8%)显著高于对照组(10.2%),川崎病组rs2293152C等位基因分布频率(45.4%)显著高于对照组(34.0%,P=0.006,OR=1.612,95%CI:1.144～2.272);而STAT3 rs957970C/T位点基因型及等位基因频率分布在川崎病组和对照组间无统计学差异(P>0.05)。结论重庆地区汉族儿童的STAT3基因内含子11中rs2293152位点多态性与川崎病易感性相关,携带rs2293152C等位基因者比G等位基因携带者易罹患川崎病,而STAT3 rs957970C/T位点多态性与该地区儿童川崎病的易感性无显著相关性。

X连锁慢性肉芽肿病12例临床分析

目的探讨X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)患儿的临床表现及实验室检查特点。方法总结12例经CYBB基因序列分析诊断为X-CGD患儿的临床资料,检测X-CGD患儿及家系成员中性粒细胞氧化功能。结果 12例患儿均为男性,平均起病年龄4.08个月,平均诊断年龄2岁。12例患儿均有反复肺炎,结核感染7例,淋巴结炎6例,反复腹泻6例,溃疡性口腔炎5例,肛周脓肿3例。均有生长发育延迟。血清IgG、IgA及IgM均升高9例。四唑氮蓝试验(NBT)和中性粒细胞氧化功能均显著下降。6例(50%)患儿死亡。大多患儿影像学检查提示有肺部、肝内肉芽肿形成;3例患儿有家族史。结论 X-CGD起病早,诊断较晚,病死率高;以肺部感染为主要表现,结核感染率高。中性粒细胞呼吸暴发试验有助于X-CGD临床诊断,CYBB基因序列分析可提高诊断准确性。

IL-18受体α链基因多态性与重庆汉族人结核病易感性的关系

目的:探讨重庆地区汉族人群白细胞介素18受体α链(IL-18Rα)基因多态性与结核病易感性的关系。方法:采用序列特异性引物多聚酶链反应(PCR-SSP)分析重庆汉族人群中427例结核病患者和469名健康对照的IL-18Rα基因的-69C/T,-638C/T位点多态性,统计分析基因多态性与结核病易感性的关系。结果:IL-18Rα基因启动子-69和-638位点核苷酸均存在C、T二态性,都表现为CC纯合、TT纯合、CT杂合三种基因型;-69C/T位基因型分布频率在结核组与对照组间差异有统计学意义,对照组CC基因型频率(41.6%)明显高于结核组(30.4%)(χ2=13.011,P=0.001),结核组的等位基因T频率(44.8%)明显高于对照组(36.6%)(χ2=11.2,P=0.001);T等位基因在结核组与对照组比较,优势比OR=1.41。-638C/T位基因型和等位基因分布频率分别在结核组与健康对照组间的分布差异均没有统计学意义(P>0.05)。结论:重庆汉族人IL-18Rα基因的-69C/T多态性与结核易感性相关,携带-69T等位基因的人群更易患结核病,而-638位C/T多态性与结核病易感性无明显相关性。

慢性肉芽肿病高危儿产前诊断研究

目的探讨羊水脱落细胞基因分析及宫内胎儿脐血中性粒细胞呼吸爆发试验在慢性肉芽肿病(CGD)高危儿产前诊断中的应用价值。方法对重庆医科大学附属儿童医院基因分析确诊的6例CGD患儿[5例X连锁CGD(X-CGD),1例常染色体隐性遗传CGD(AR-CGD)]家系中8例高危儿经羊膜腔穿刺抽取羊水,提取羊水脱落细胞RNA和DNA,经PCR扩增、测序分析CYBB或CYBA基因;其中2例高危儿在B超引导下,经皮采集胎儿脐血,采用流式细胞术检测中性粒细胞呼吸爆发功能,对上述基因进行分析。结果羊水脱落细胞CYBB、CYBA基因分析结果显示:在5例X-CGD患儿家系的7例高危儿中,1例为正常女性胎儿,2例女性胎儿突变基因携带情况不明确,1例为正常男性胎儿,2例为X-CGD男性胎儿,1例为可疑X-CGD男性胎儿;1例AR-CGD患儿家系中的高危儿为可疑AR-CGD女性胎儿。上述2例可疑CGD胎儿脐血中性粒细胞呼吸爆发功能均异常低下,脐血基因分析验证1例为X-CGD男性胎儿,1例为AR-CGD女性胎儿。4例正常胎儿顺利出生,4例CGD胎儿行人工流产术。结论羊水脱落细胞基因分析与宫内胎儿脐血中性粒细胞呼吸爆发试验相结合,可为CGD高危儿提供可靠的产前诊断。

4例高IgE综合征的临床分析和基因诊断

目的探讨高IgE综合征(hyper-IgE syndrome,HIES)的临床特征和基因诊断价值。方法用NIH评分系统对2009年1-7月在重庆医科大学附属儿童医院就诊的4例(男性3例,女性1例)疑似HIES患儿进行评分,总分大于40分为临床诊断标准。用RT-PCR及PCR直接测序法,分析患儿STAT3基因。结果 4例患儿均有反复顽固的湿疹、肺炎、血清IgE异常增高及嗜酸性粒细胞增多。除例4外,其余3例均有反复金黄色葡萄球菌感染。例1～4 NIH评分分别为60、48、72、48分。除例4无STAT3基因突变外,例1～3均有STAT3杂合的错义突变,包括1例新型突变,2例热点突变。结论临床诊断的4例HIES中3例有自发性STAT3基因突变,其中1例为新型突变。对临床怀疑HIES患者应进行NIH评分,超过40分者分析STAT3基因可确诊或排除常染色体显性遗传高IgE综合征。

全反式维甲酸对阿霉素肾病小鼠肾脏保护作用研究

目的:探讨全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)对阿霉素肾病模型小鼠的肾脏保护作用。方法:将30只BALB/c小鼠,随机分为正常组、阿霉素肾病模型组(模型组)和阿霉素肾病ATRA治疗组(ATRA治疗组),分别腹腔注射给药至10周。免疫组化分析肾脏凋亡蛋白Fas抗原及Fas抗原配体(Fas ligand,FasL)的表达水平,Real-time PCR技术检测肾脏Fas抗原、FasL的mRNA表达。结果:模型组与对照组比较,尿蛋白、血脂总胆固醇([Total cholesterin,TC),(3.09±0.89)mmol/L]、甘油三酯([Triglyceride,TG),(1.33±0.29)mmol/L]水平明显升高(P值均小于0.05);ATRA治疗组与模型组比较TC、TG分别为([1.27±0.31)mmol/L、(1.12±0.45)mmol/L]明显降低(P均小于<0.05)。免疫组化分析:模型组与正常组比较,Fas抗原、FasL表达增加,分别为(650.141 6±153.997 0)、(350.190 7±204.220 6),且差异有统计学意义(P<0.05),治疗组与模型组比较,Fas抗原、FasL表达减少,且差异有统计学意义(P<0.05)。Real-time PCR分析,模型组与正常组相比较,肾组织的Fas抗原、FasL的表达明显升高,分别为(2.953 7±1.558 1)、(3.680 6±0.273 1)(P<0.05);ATRA治疗组与模型组相比较Fas抗原、FasL明显增强,分别为(0.601 3±0.249 9)、(0.729 9±0.730 4)(P<0.05)。结论:ATRA可能通过降低肾脏Fas抗原、FasL的表达而对肾脏起到保护作用。

4例Chediak-Higashi综合征的临床特征和LYST基因分析

目的探讨4例Chediak-Higashi综合征(Chediak-Higashi syndrome,CHS)的临床特征和LYST基因突变情况。方法分析4例CHS的临床资料和实验室检查结果;提取患儿及父母等亲属外周血DNA和RNA;采用DNA-PCR/RT-PCR直接测序法分析患儿的致病基因LYST;根据患儿突变点对亲属相应位点做PCR扩增和测序,确认携带者。结果 4例CHS患儿均为女性,平均年龄3岁2个月。均有色素减退,双眼震颤,显微镜见头发黑色素减少为小点状分布。病例1～3还有发热、血细胞2系以上降低、骨髓有核细胞巨大包涵体等特征,诊断Chediak-Higashi综合征(加速期)。病例4年幼,表现不典型,临床诊断CHS。病例1～3存在LYST基因突变,各含2个突变位点,病例1(c.3113C>T,Q980X和c.6788A>T,K2205X),病例2(c.5327C>T,R1718X和c.608C>T,R145X),病例3(c.5411-5414 del TTTC,L1741fsX1758和c.7975 C>T,R2596X)。6个突变均为新型突变。共确认8位携带者。病例4暂未发现LYST基因突变。结论 Chediak-Higashi综合征具有色素减退、双眼震颤、头发黑色素减少为小点状分布和骨髓有核细胞巨大包涵体的临床特征,通过LYST基因分析,发现其中3例存在6个新型突变点。

儿童原发性免疫缺陷病135例临床分析

目的分析儿童原发性免疫缺陷病(PID)的临床发病及诊断情况,增强儿科医师对该类疾病的认识。方法回顾性分析重庆医科大学附属儿童医院1993年5月至2007年12月诊断的135例PID患儿的临床资料,包括发病时症状体征、性别、发病年龄、家族史、免疫学结果及诊断情况。结果135例患儿中以抗体缺陷最多,占34.8%,吞噬细胞缺陷占18.5%,其他明确的免疫缺陷综合征占14.8%,联合免疫缺陷占11.9%,免疫失调性疾病占5.9%,补体缺陷占0.7%,其他PID占13.3%。男女比例为110∶25,临床诊断与基因诊断比例为98∶37。1993—1996年诊断9例,1997—2000年诊断23例,2001—2003年诊断31例,2004—2007年诊断72例,诊断病例数逐年增加。其中2001—2003年基因诊断7例,2004—2007年基因诊断30例。结论PID为一组主要见于婴幼儿的遗传病,是引起儿童反复、严重、致残、致死性感染的重要原因。近年来诊断的PID病例数逐年增加,基因分析是确诊该类疾病的重要手段。

川崎病急性期患者Th17细胞检测及意义

目的:探讨川崎病患者急性期Th17细胞的水平及意义。方法:急性期川崎病(KD)患儿43例,正常同年龄对照41例,采用流式细胞术检测外周血单个核细胞(PBMC)中Th17细胞占CD4+细胞的比例。荧光定量PCR(Real-time-PCR)检测RORγt和IL-23p19mRNA的表达。双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-6水平。结果:急性期KD患儿外周血Th17细胞比例及其特异性转录因子RORγt的mRNA表达分别为:(1.285±0.625)%、(M:5.62,Q:7.16),显著高于同龄对照组(0.584±0.407)%、(M:1.79,Q:2.55),(P<0.01)。KD患儿血清IL-6水平显著增高[病人:(M:36.42,Q:129.77)、对照:(M:2.39,Q:1.15)](P<0.01),且与Th17细胞比例成正相关(r=0.88,P<0.01)。IL-23p19的mRNA表达与正常对照比较无显著差异[病人:(M:2.12,Q:3.05)、对照:(M:1.73,Q:2.79)](P>0.05)。结论:急性期川崎病患者Th17细胞数量、血清IL-6水平升高;Th17可能作为急性炎症的启动因素,参与川崎病免疫发病过程。

卵清蛋白激发对肠道菌群失调小鼠T细胞功能亚群的影响

目的:探讨卵清蛋白(OVA)雾化吸入激发对抗生素致肠道菌群失调小鼠肺组织及脾脏中T淋巴细胞功能亚群的影响。方法:32只BALB/c小鼠随机分为4组:菌群失调组、菌群失调加激发组、激发组、对照组。于实验第14天采用流式细胞术(FCM)检测肺组织及脾脏中Th1、Th2、Th17以及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Tregs)水平。结果:菌群失调加激发组小鼠肺组织中Th2、Th17细胞水平增高,脾脏中Th1、Th2、Th17均与对照组无差异;菌群失调组及菌群失调加激发组小鼠肺组织及脾脏中Tregs水平均降低。结论:抗生素致肠道菌群失调小鼠经卵清蛋白雾化吸入激发后,可产生Th2、Th17细胞优势的变应性气道反应,与Tregs调节功能不足可能有关。

急性期川崎病信号转导和转录激活因子3的表达及意义

目的:探讨急性期川崎病IL-6介导信号转导和转录激活因子3的表达及意义。方法:急性期川崎病(KD)患儿64例,感染发热患儿18例,正常同年龄对照42例。采用Western blot检测外周血单个核细胞(PBMCs)IL-6刺激前后总蛋白,核蛋白STAT3,pSTAT3的表达水平。荧光定量PCR检测PBMCs IL-6刺激前后及IL-6R抗体阻断后STAT3 mRNA的表达水平。结果:急性期KD患儿PBMCs用IL-6刺激前、后总蛋白STAT3,pSTAT3表达水平高于正常儿童;核蛋白则为IL-6刺激前KD患儿STAT3,pSTAT3表达与正常儿童无明显差异,IL-6刺激后KD患儿STAT3,pSTAT3表达明显高于正常儿童。IL-6刺激前、后KD患儿STAT3 mRNA水平(1.15±0.19,1.74±0.59)均高于感染发热患儿(1.07±0.21,1.45±0.32)及正常儿童(0.56±0.37,1.03±0.51);KD冠脉损伤组(1.19±0.21,1.81±0.47)STAT3 mRNA高于冠脉未损伤组(1.13±0.29,1.73±0.48)。经IL-6R抗体阻断后,KD患儿STAT3 mRNA水平低于IL-6刺激前、后KD患儿及感染发热组(0.99±0.15)。结论:急性期KD患儿体内存在刺激STAT3表达和活化的因素,体外IL-6刺激能增强STAT3的表达和活化并进入细胞核;阻断实验提示IL-6在KD患儿STAT3过度表达、活化中起主导作用,本研究为用IL-6R阻断剂治疗川崎病提供了实验证据。

12例X连锁慢性肉芽肿病的基因诊断

目的:通过分析12例X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)的CYBB基因变异,探讨基因诊断在确诊该病中的价值。方法:根据患儿临床特征及四唑氮蓝试验(NBT)初步筛查结果:,运用流式细胞术中性粒细胞呼吸爆发试验,检测11例X-CGD患者及家系成员的中性粒细胞氧化功能,采用PCR及RT-PCR直接测序法,分析12例患儿及其家系外周血细胞的CYBB基因,并为1例CYBB突变基因携带者的胎儿分析羊水细胞的CYBB基因。结果:患儿均有反复感染史,NBT显著降低(0～6%),11例患儿中性粒细胞氧化指数(NOI)为1～2,明显低于正常人(>100),初步诊断为X-CGD;12例患儿中,11例存在CYBB基因突变:缺失突变4例,拼接错误突变4例,无义突变2例及错义突变1例。其中7种突变(1341delT,1182delC,1091delG,IVS10-2A>C,IVS10+2dupT,497-498ins115bp,591T>C)为新型突变。除了例3患儿母亲不是携带者,例9患儿母亲是否为携带者尚不明确,其余9个患儿母亲均为携带者,例6母亲的胎儿正常。结论:CYBB基因分析有助于X-CGD患儿的进一步明确诊断,在检测携带者及产前诊断中起着重要作用,并为干细胞移植治疗患者提供依据。

中性粒细胞中Toll样受体的表达与功能

中性粒细胞是最重要的固有免疫细胞,通过黏附、趋化、识别、脱颗粒、杀伤和降解等一系列过程杀灭病原微生物,介导炎症反应。整个过程受到众多细胞因子及其受体的调控,Toll样受体(TLR)作为最主要的固有免疫识别受体,在中性粒细胞的聚集、活化和凋亡中都起着重要的调控作用。

白细胞介素-27基因多态性与结核病易感性的关系

目的:探讨重庆地区汉族人群白细胞介素-27(IL-27)基因多态性与结核病易感性的关系.方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)和序列特异性引物多聚酶链反应(PCR-SSP)分析385例结核病患者和391例健康对照的IL-27基因的-964A/G和2905T/G位点多态性,统计分析基因多态性与结核病易感性的关系.结果:IL-27基因-964位点存在A、G二态性,表现为AA纯合、GG纯合、AG杂合三种基因型,2905位点存在T、G二态性,表现为TT纯合、GG纯合、TG杂合三种基因型.IL-27基因的-964A/G位等位基因和基因型分布频率分别在结核组与对照组间的差异均有统计学意义(P<0.05),结核组的等位基因A频率(66.4%)明显高于对照组(59.1%)(χ2=8.80,P=0.003),结核组AA基因型频率(48.1%)明显高于对照组(38.1%)(χ2=7.83,P=0.005).-964A/G位等位基因和基因型分布频率在结核菌阳性患者组与结核菌阴性患者组间的差异亦有统计学意义(P<0.05),结核菌阳性组的A等位基因频率(70.8%)明显高于结核菌阴性组(61.1%)(χ2=8.11,P=0.004).2905T/G位基因型和等位基因分布频率在结核组与对照组间差异无统计学意义.结论:IL-27基因-964A/G多态性与结核病易感性相关,携带-964A等位基因的人群更易患结核病,结核分枝杆菌阳性率高,而2905位T/G多态性与结核病易感性无明显相关性.

P53基因对K562细胞增殖的影响

目的 观察恢复K5 6 2细胞的p5 3蛋白功能后该细胞的生物学行为的改变 ,探索用野生型p5 3基因治疗白血病的可能性。方法 以K5 6 2细胞为研究对象 ,电穿孔法转导野生型p5 3基因 ,RT PCR和免疫细胞化学方法检测p5 3基因的表达 ,3H TdR掺入法检测细胞增殖 ,用流式细胞仪分别以TUNEL、annexin V、细胞周期检测细胞的凋亡情况和细胞周期分布情况。结果 转染p5 3基因的K5 6 2细胞 ,出现明显细胞周期G1 期停滞 ,增殖抑制率为 2 4 .17% ,但用TUNEL、annexin V和亚二倍体峰检测未发现与未转染p5 3基因组有凋亡细胞比例差异。结论 P5 3基因对K5 6 2细胞有一定的治疗效应 。

X-连锁慢性肉芽肿病CYBB基因突变分析及产前诊断

目的分析X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)的临床特征及CYBB基因突变。方法回顾分析1例X-CGD患儿的临床资料及其家系的CYBB基因检测结果。结果男性患儿,新生儿期起病,以反复严重的肺部感染为主要表现。患儿无刺激组及脂多糖(LPS)刺激组四唑氮蓝试验(NBT)均为0%,中性粒细胞氧化指数(NOI)为1.15。基因分析显示,患儿CYBB基因第6外显子出现缺失突变(579-582del ATTA),由此引起编码序列从189位异亮氨酸(I)发生移码突变,于212位氨基酸提前出现终止密码子(I 189 fs X 212)。患儿母亲及外祖母均为突变基因携带者。患儿母亲下一胎羊水细胞的CYBB基因未发现相同缺失突变。结论基因诊断1例CYBB基因突变X-CGD患者及其家系,产前基因检测可避免X-CGD患儿出生。

原发性免疫缺陷病合并卡介苗感染新型白介素12受体β1基因突变一例

目的分析一例白介素12受体β1（IL-12Rβ1）缺陷基因突变合并卡介苗感染患儿的临床特征、基因分析和蛋白表达。方法根据典型的临床表现及免疫学筛查实验排除常见原发性免疫缺陷病（PID），用单克隆抗体流式细胞术检测患者和母亲EB病毒（EBV）永生化的B细胞上IL-12Rβ1蛋白表达，同时，用正向、反向引物分别对患儿和其父、母的IL-12Rβ1基因进行PCR扩增并测序，患儿弟弟产前、产后均已作IL-12Rβ1基因分析。结果患儿有严重、播散性卡介苗接种病，其永生化的B细胞上IL-12Rβ1蛋白表达呈阴性，母亲有部分蛋白表达。患儿为IL-12Rβ1基因纯合单核苷酸替换突变，其第9外显子853位核苷酸（C→T）发生无义突变，使第285位谷氨酸突变为终止密码（Q285X），其父、母亲均为该异常基因的携带者，患儿弟弟产前产后IL-12Rβ1基因正常。结论鉴定出一例新型IL-12Rβ1基因突变（Q285X）患者，发现此基因突变患者的IL-12Rβ1蛋白缺乏，确定此基因突变是引起患者发生播散性卡介苗接种病的根本原因；明确家庭成员携带情况，为产前诊断提供依据。

小儿卡介苗接种不良反应73例临床分析

卡介苗接种计划可减少儿童潜伏结核感染的疾病负担，减少活动性结核。卡介苗是一种减毒的牛结核分枝杆菌，进入机体后复苏增殖，刺激机体产生致敏淋巴细胞，从而形成免疫保护。部分婴儿接种卡介苗后可出现不良反应，但并不常见。据报道，卡介苗总体接种不良反应发生率为0．11％（1／931）[1]。本研究收集73例卡介苗接种不良反应患儿，分析其易感因素及临床表现，以提高医疗工作者对卡介苗接种不良反应的认识。