重庆地区28287例疑似地中海贫血儿童基因检测分析

目的:探讨重庆地区儿童地中海贫血基因检测阳性情况、基因型及分布特征。方法:对2011年1月至2022年12月重庆医科大学附属儿童医院就诊的28287例经血液学筛查疑似地中海贫血儿童进行常见α和β地中海贫血基因突变位点检测,分析检出率和地中海贫血携带者检出构成比的变化趋势及基因型分布情况。结果:在28287例疑似地中海贫血儿童中,共检测出15249例地中海贫血患者,阳性率为53.91%。α、β、αβ地中海贫血阳性率分别为22.41%(6340例)、30.43%(8609例)和1.06%(301例),中重型地贫阳性率为2.47%(698例)。2011年至2022年间随年龄增加各组α地中海贫血携带者检出构成比的线性回归k值分别为-0.002、0.004、0.006、0.010、0.012,而β地中海贫血分别为0.011、0.004、0.002、-0.001。共检出21种α地中海贫血基因型,其中α地中海贫血主要基因型为--SEA/αα,占比69.58%。共检测出46种β地中海贫血基因型,其中β地中海贫血主要基因型为CD17/βN、CD41-42/βN及IVS-Ⅱ-654/βN,占比分别为31.75%、27.92%、25.21%,一共为84.88%。结论:重庆地区儿童地中海贫血常见基因突变位点检测阳性率较高,中重型比例也较高。2011年至2022年间α地中海贫血携带者随年龄段增大检出率升高,而β地中海贫血降低,表明部分β地中海贫血患者基因诊断时间较晚。重庆地区儿童地中海贫血基因型集中在--SEA/αα、CD17/βN、CD41-42/βN及IVS-Ⅱ-654/βN,与重庆地区成人一致,与广东、广西等地贫高发区有差异。这些结果对于本地区地中海贫血的干预和预防具有重要意义。

儿童急性淋巴细胞白血病β-arrestin1表达升高的临床意义

目的探讨β-arrestin1在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)中的表达及临床意义。方法收集155例初发ALL患儿的骨髓样本(ALL组),分离单个核细胞,以51例非恶性血液疾病患者作为对照(Ctrl组),将ALL患者分成高危、中危和标危组,采用实时荧光定量RT-PCR法检测β-arrestin1 mRNA的表达,采用蛋白质印迹法和免疫荧光法检测β-arrestin1蛋白表达的变化。用Spearman统计分析β-arrestin1表达与ALL患者临床和生物学特点之间的相关性。结果 ALL组β-arrestin1 mRNA和蛋白表达均高于Ctrl组(P值均<0.01)。高危组和中危组β-arrestin1 mRNA表达高于标危组,且高危组β-arrestin1 mRNA表达高于中危组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关分析显示,β-arrestin1表达与外周血白细胞数(r=0.458,P=0.002)和危险分级(r=0.344,P=0.022)正相关。结论儿童ALL患者骨髓β-arrestin1表达水平与患者的危险分级密切相关,对ALL诊断、治疗策略和预后具有重要意义。

DACT1基因羟甲基化在儿童WT1、IDH1/2、TET2基因突变的急性髓细胞白血病中的特征及临床意义

目的:研究dapper,β-连环蛋白拮抗剂,非洲爪蟾同系物1(dapper,antagonist of beta-catenin,homolog 1 Xenopus laevis,DACT1)在儿童急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)中的羟甲基化特征及其与预后的关系,寻找AML新的危险分层分子标志物。方法:测序分析本院血液科初发AML188例,根据是否存在Wilms肿瘤因子1(Wilms tumor 1,WT1)、异柠檬酸脱氢酶1/2(isocitrate dehydrogenase 1/2,IDH1/2)或TET蛋白2(ten-eleven translocation,TET2)基因突变,将病例分为WIT-AML组(30例)和非WIT-AML组(158例);用糖基化qPCR及qPCR方法检测WIT-AML(16例)、非WIT-AML(14例)和非AML患儿(14例)的DACT1基因羟甲基化水平(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)和表达水平,并用Spearman法研究羟甲基化与表达的相关性;随访患儿的缓解、复发及生存情况,采用COX回归分析DACT1羟甲基化对AML患儿总生存率(overall survival,OS)及无病生存率(event free survival,EFS)的影响。结果:WIT-AML组的DACT1 a、b区域(DACT1 a/b)甲基岛(CpG)羟甲基化(5hmC)水平较非WIT-AML组低(Ua=48.00,Pa=0.008;Ub=19.00,Pb=0.000),且其基因表达明显减低(Uexp=0.00,Pexp=0.000);DACT1 a/b甲基岛5hmC与DACT1的表达水平呈正相关(ra=0.812,Pa=0.000;rb=0.789,Pb=0.000);DACT1a 5hmC水平减低是EFS的危险因素(HR=3.896,95%CI=1.161~13.073,P=0.028),同样也是OS的危险因素(HR=4.109,95%CI=1.226~13.771,P=0.022)。结论:在WITAML中,DACT1 5hmC水平和表达水平明显降低,DACT1a区5hmC水平降低可增加儿童AML生存风险,可作为AML一个新的独立预后不良指标。

儿童急性B淋巴细胞白血病中IKAROS家族锌指转录因子1基因异常的特征及临床意义

IKAROS家族锌指转录因子1(IKZF1)基因编码IKAROS蛋白,是一种重要的锌指样转录因子,在B淋巴细胞增殖、分化及功能维持过程中发挥着重要的调控作用。IKZF1基因被认为是一个临床相关的肿瘤抑制因子,IKZF1缺失致IKAROS单倍体剂量不足或显性负相与急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的发生发展紧密相关。因此,研究IKZF1基因可为B-ALL的危险度分层提供新的分子标志物,有助于B-ALL个体化治疗。

外周血T淋巴细胞亚群和细胞因子在儿童肺炎支原体肺炎诊断中的意义

目的探讨外周血T淋巴细胞亚群(CD4^+、CD8^+T细胞)及细胞因子[白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10和肿瘤坏死因子(TNF)-α]在儿童肺炎支原体肺炎(MPP)诊断中的意义。方法采用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测153例MPP患儿(疾病组)和122例健康儿童(对照组)外周血CD4^+、CD8^+T细胞比例,IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平,并对疾病组治疗前、治疗后及疾病组并发胸腔积液伴肺纤维化(纤维化组)与不伴有肺纤维化(非纤维化组)数据进行统计分析。结果疾病组治疗前外周血IL-6、IL-8、IL-10和TNF-ɑ水平及CD8^+T细胞比例均显著高于治疗后和对照组,CD4^+T细胞比例和CD4^+/CD8^+均低于治疗后和对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。疾病组治疗后外周血IL-6、IL-8、IL-10水平高于对照组,CD4^+、CD8^+T细胞比例低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。纤维化组外周血IL-6、IL-8、IL-10水平和CD8^+T细胞比例高于非纤维化组,CD4^+T细胞比例和CD4^+/CD8^+低于非纤维化组,差异有统计学意义(P<0.05)。受试者工作特征曲线表明,IL-6和IL-8辅助诊断肺纤维化的敏感性和特异性较高,敏感性分别为100.0%和92.6%,特异性分别为95.6%和93.0%。结论联合检测外周血CD4^+、CD8^+、CD4^+/CD8^+比例及细胞因子IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平有助于全面了解MPP患儿治疗前、后免疫功能的变化。外周血IL-6和IL-8最有助于MPP患儿肺纤维化的辅助诊断。

急性髓系白血病患儿FLT3-ITD、CEBPA、NPM1、DN-MT3A、RAS基因突变特征及临床意义

目的探讨急性髓系白血病(AML)患儿FLT3、CEBPA、NPM1、DNMT3A、NRAS和KRAS基因突变特征及其临床预后意义。方法收集217例初诊AML患儿骨髓标本,采用PCR扩增产物Sanger测序法检测FLT3、CEBPA、NPM1、DNMT3A、NRAS和KRAS基因突变情况,收集临床资料,探究各基因突变的临床特征及预后意义。结果本研究中突变率最高的是NRAS(11.9%),其他依次为CEBPA(10.0%)、FLT3-ITD(5.7%)、KRAS(3.0%)、NPM1(1.4%),未检测出DNMT3A突变。KRAS突变均发生于M5型,NPM1突变均发生于M2型。FLT3-ITD突变组外周血白细胞计数(×109/L)较非突变组明显升高[104.0(19.8,201.0)vs 11.4(3.8,38.7),Z=-3.061,P=0.002];KRAS突变组年龄明显低于非突变组[2.0(1.0,3.3)岁vs 7.0(3.0,10.0)岁,Z=-2.282,P=0.005]。FLT3-ITD突变组患儿总生存率较非突变组明显降低(25.0%vs 52.5%,χ2=4.993,P=0.026);无病生存率呈减低趋势(33.3%vs 60.6%,χ2=3.750,P=0.053)。RAS突变组与非突变组预后差异无统计学意义。结论 FLT3-ITD突变是AML患儿患者的不良预后指标。

重庆部分地区苯丙氨酸羟化酶缺乏症患儿基因突变分析

目的探讨重庆部分区域苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)缺乏症基因突变频率和特征,为PAH缺乏症的诊断及治疗提供依据。方法回顾性分析2014年1月1日至2020年10月25日在重庆医科大学附属儿童医院确诊的45例PAH缺乏症患儿,将苯丙氨酸羟化酶缺乏症分型为经典型苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)、轻度PKU及轻度高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia,HPA),分析其二代高通量测序及多重连接依赖探针扩增技术检测的PAH基因突变情况以及Sanger测序技术对其父母相应变异位点的验证结果。结果①45例高苯丙氨酸血症患者中43例均检出2个变异位点(40例为复合杂合突变,3例为纯合突变),且所检测突变位点均来自父母;另外2例为杂合突变,仅检测到1个变异位点。②45例PAH缺乏症患者共检出34种突变,主要以错义突变(52.9%)为主,c.728G>A突变频率最高(15.9%,14/88),其次为c.158G>A(11.4%,10/88)、c.1197A>T(9.1%,8/88)及c.721C>T(9.1%,8/88)。高频突变的区域在第7外显子,包含4种突变,26个变异位点(29.5%)。③13例经典型PKU患者检测到11种PAH基因突变,其中突变频率最高的为c.728G>A(8/25,32%);8例轻度PKU患者检测到9种PAH基因突变,c.728G>A(3/15,20%)突变频率最高;24例轻度HPA患者共检出24种PAH基因突变,其中c.158G>A(10/48,20.8%)突变频率最高。结论重庆市PAH缺乏症患者PAH基因突变以复合杂合为主,主要变异类型为错义突变,具有明显的热点突变(c.728G>A、c.158G>A、c.721C>T及c.1197A>T)。

14例单纯型与合并型甲基丙二酸血症的临床资料分析

目的 :总结2017年至今重庆医科大学附属儿童医院筛查确诊及随访的单纯型及合并型甲基丙二酸血症患儿的临床特点、实验室检查及基因等。方法:分析甲基丙二酸血症(methylmalonic acidemia,MMA)患儿临床表现及发病特点,分析首次串联质谱中丙酰基肉碱、丙酰基肉碱/乙酰基肉碱、尿甲基丙二酸、血同型半胱氨酸、血氨乳酸、血液分析及基因核苷酸结果等。结果:MMA主要表现有喂养困难、反应弱、惊厥及发育迟缓等,发病到治疗及确诊间隔越长,预后较差。实验室检测主要表现高氨血症6例(42.9%)、贫血5例(35.7%)、粒细胞减低7例(50%)、血小板减少5例(35.7%),63.6%的伴同型半胱氨酸血症增高;单纯型全部存在高氨血症;单纯型较合并型MMA患儿丙酰基肉碱及尿甲基丙二酸水平升高而丙酰基肉碱/乙酰基肉碱稍低,均无明显统计学意义;基因核苷酸改变以错义突变为主,其次为插入/缺失及重复。12例头颅MRI/CT结果提示7例脑萎缩、4例脑水肿及1例髓鞘化延迟,2例头颅彩超显示脑室稍增宽。结论:MMA患儿临床表现及实验室检查均缺乏特异性,串联质谱及尿有机酸可进行初步确诊,尽快治疗的同时尽早完善基因确诊。

287例唐氏综合征患儿细胞及分子遗传学分析

目的:了解我院确诊的唐氏综合征(Down’s syndrome,DS)患儿核型分布情况;比较荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)较常规G显带染色体核型分析技术在确诊并检出嵌合型DS患儿异常核型方面的优势。方法:采集疑诊为DS患儿的血液进行常规G显带染色体核型分析,描述DS患儿核型分布情况;从经常规G显带染色体核型分析确诊为嵌合型DS的患儿中随机抽取5名进行FISH分析,对比2种方法检出异常核型百分比的差异。结果:本文检出的DS患者共287例,其中单纯型达91.29%,占DS患者中的绝大多数,易位型DS患者中,D/G易位11例,占73.33%,G/G易位4例,占26.67%。本文易位型DS患者中有1例为D/G易位嵌合型,以往文献罕见报道;常规G显带染色体核型分析确诊为嵌合型DS的患儿经FISH分析全部为嵌合型,2种方法检出异常核型的比例无统计学差异。结论:本文所收集的DS患儿核型以单纯型占绝大多数,易位型患儿中以D/G易位多见。常规染色体核型分析技术能准确诊断DS,但对于3倍体细胞所占比例较少,临床表现较轻的嵌合型DS患儿建议采用FISH计算异常细胞百分率。

Citrin蛋白缺乏所致新生儿肝内胆汁淤积症患儿临床特征及基因分析

目的:分析citrin蛋白缺乏所致新生儿肝内胆汁淤积症(NICCD)患儿的临床特征及基因突变特点。方法:回顾性分析2012年9月至2017年12月于重庆医科大学附属儿童医院就诊的30例NICCD患儿和同期诊治的30例特发性新生儿胆汁淤积症(INC)患儿的临床表现、生化指标和目标基因捕获结合高通量测序和桑格-库森法验证结果。结果:NICCD与INC临床表现相似,但圆胖脸和陶土便在NICCD患儿中更为常见(均P<0.01)。NICCD组血糖、前白蛋白、白蛋白、总蛋白、纤维蛋白原、转氨酶水平较INC组低(P<0.05或P<0.01),而间接胆红素、总胆汁酸、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、血氨、甲胎蛋白、凝血功能标志物较INC组均升高(P<0.05或P<0.01);INC组血氨基酸水平多在正常值范围内,而NICCD组血瓜氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、精氨酸及苏氨酸水平均升高(均P<0.01);INC组尿有机酸轻度升高或正常,而NICCD组尿4-羟基苯乳酸、4-羟基苯丙酮酸及苯乳酸浓度显著升高(均P<0.01)。NICCD组均存在SLC25A13突变,其中8例为纯合突变,9例为复合杂合突变,13例为单位点突变,以c.851_854del(53.19%)最常见,同时发现2个新的致病性突变c.1196T>A和c.919G>T。结论:对于新生儿肝内胆汁淤积症并伴有圆胖脸、陶土便的患儿应警惕NICCD,血氨、甲胎蛋白、瓜氨酸以及尿4-羟基苯乳酸、4-羟基苯丙酮酸、苯乳酸水平升高可为临床诊断提供重要依据,目标基因捕获结合高通量测序对其诊断及鉴别诊断具有重要价值。

外周血单个核细胞多药耐药相关基因含量监测在儿童恶性肿瘤中的应用

目的:建立检测多药耐药(multi-drug resistance,MDR)相关基因荧光定量RT-PCR方法,并动态监测肿瘤患者外周血MDR相关基因(MDR1、MRP1和LRP)含量,探讨是否根据这些基因含量来指导肿瘤化疗。方法:利用Taq-Man探针方法,建立检测MDR相关基因的荧光定量RT-PCR方法。以健康对照组50例,肿瘤(含淋巴瘤、神经母细胞瘤、卵黄囊瘤等)组262例,化疗不同时期抽取患者外周血950份,提取RNA,检测单个核细胞内MDR相关基因(MDR1、MRP1和LRP)含量,分析这些基因的含量与肿瘤化疗方案的关系。结果:成功建立以Taq-Man探针为基础的MDR相关基因荧光定量RT-PCR方法。①与健康对照组相比,肿瘤组患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear,PBMC)MDR1基因起始含量较高,尤以神经母细胞瘤和卵黄囊瘤为甚,这2类肿瘤可能存在一定程度的原发耐药性。②对同一肿瘤患者,化疗后PBMC MDR1含量随化疗疗程增加而逐渐增高,以神经母细胞瘤和卵黄囊瘤最为敏感。结论:MDR1、MRP1和LRP含量与肿瘤的化疗方案密切相关,PBMC和肿瘤组织中MDR1的表达与化疗疗效呈显著负相关。检测外周血中MDR1基因的含量能够动态监测肿瘤患者的MDR,利用荧光定量RT-PCR方法动态监测肿瘤患者化疗前后外周血MDR相关基因(MDR1、MRP1和LRP)的含量,对化疗疗效监测及预后判定具有一定的参考价值,可以用来指导相关基因底物的肿瘤药物化疗。

基因组技术在肿瘤分子诊断中的应用

肿瘤是基因组疾病,基因组变化在肿瘤发生和发展中起着重要的作用。近20年来随着肿瘤基因组研究的不断深入,发现了许多肿瘤基因组在DNA、基因表达、遗传表观等不同水平的变化特征,为基因组水平肿瘤分子诊断和分型奠定了理论基础。由于肿瘤临床标本的特殊性,传统的分子生物学技术无法有效地分析肿瘤基因组变化。随着以基因芯片和第二代DNA测序(Next generation sequencing,NGS)技术为代表的全基因组分析技术的迅速发展,为高容量和高精密度分析肿瘤基因组变化提供新的手段。本文综述目前国际上主要的基因组分析技术,重点介绍其在肿瘤分子诊断中的应用价值,展望全基因组技术在肿瘤诊断和个体化治疗上的应用前景。

EB病毒和人巨细胞病毒感染对儿童急性淋巴细胞白血病PTEN及hTERT基因甲基化的影响

目的探讨EB病毒(EBV)与人巨细胞病毒(HCMV)感染对儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)相关基因PTEN及hTERT甲基化的影响及其意义。方法收集初发儿童ALL患者外周血标本100例,取血浆进行病毒感染血清学检测,据血清学结果分为EBV单独感染组(20例),HCMV单独感染组(14例)EBV、HCMV联合感染组(41例)及全阴性对照组(15例)。从外周血标本分离单个核细胞,提取DNA,亚硫酸氢钠盐修饰后,采用甲基化特异性(MS)-PCR法检测各组PTEN及hTERT基因DNA启动子区甲基化水平的变化。结果 EBV、HCMV联合感染组与对照组及单独感染组相比PTEN基因甲基化水平明显降低(P<0.05),hTERT甲基化水平有明显升高(P<0.05)。结论在儿童急性淋巴细胞白血病中,EBV和HCMV病毒联合感染使肿瘤相关基因PTEN及hTERT的甲基化水平改变,提示病毒感染可参与到基因表观遗传学调控,后续的研究还需进一步证明。

hsa_circ_0001708与IKZF1的比值在儿童急性B淋巴细胞白血病诊断及分型中的价值

目的探讨hsa_circ_0001708与IKZF1在儿童急性B淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMNC)中的拷贝数比值及其在儿童B-ALL诊断及分型中的临床意义。方法利用T-A克隆构建包含hsa_circ_0001708反向剪接位点的重组质粒,梯度稀释重组质粒作为标准品建立检测hsa_circ_0001708的绝对RT-qPCR方法。收集2016年1月至2019年1月重庆医科大学附属儿童医院血液科初诊的159例B-ALL患儿骨髓标本为研究对象。对照组为同期就诊的17例非恶性血液病患儿的骨髓标本。采用绝对RT-qPCR方法检测B-ALL患儿和对照患儿BMNC中hsa_circ_0001708和IKZF1的绝对拷贝数,按患者年龄、性别、外周血白细胞数、分子生物学、遗传学、免疫分型、随访期是否复发及随访期末是否生存等临床特点进行分组。回顾性分析hsa_circ_0001708和IKZF1的比值在各组中的表达情况及与以上各因素的相关性。结果建立精确定量hsa_circ_0001708拷贝数的绝对RT-qPCR方法。与非血液肿瘤对照患儿相比,hsa_circ_0001708与IKZF1的比值在儿童B-ALL中升高(P<0.01),ROC曲线下面积为0.7936。相关性分析结果提示,hsa_circ_0001708与IKZF1的比值在外周血高白细胞数组、外周血高原始细胞数组、免疫分型pre-B组和细胞遗传学预后较差组中升高(P<0.05)。结论hsa_circ_0001708与IKZF1的比值对儿童B-ALL有潜在诊断价值,且与B-ALL患儿的MIC分型密切相关。

建立HPLC法检测血清尿刊酸并探讨其对儿童白血病的意义

目的建立利用高效液相色谱法(HPLC)检测血清尿刊酸(UCA)的方法,探讨血清UCA浓度对儿童急性白血病的临床意义。方法建立HPLC测定血清UCA浓度的方法,设定与优化HPLC色谱条件并进行验证。收集确诊为急性初诊白血病和非肿瘤血液疾病患者各90例的血清,检测UCA浓度,比较两组间的差异,并探究UCA浓度在白血病中的临床意义。结果成功优化并建立HPLC检测血清UCA方法,流动相乙腈:20 mmol/L KH2PO4,p H3.7为5∶95(V/V),流速为1.2 m L/min,检测波长264 nm的HPLC色谱条件下,反式尿刊酸(trans-UCA)和顺式尿刊酸(cis-UCA)浓度在0.125 g/L^5 g/L范围内与洗脱峰面积呈良好线性关系(R2分别为0.999 6和0.999 9)。批间测量和批内测量的相对标准偏差(RSD%)<5%。与对照组相比,急性白血病患儿血清中cis-UCA和trans-UCA浓度明显增高(P<0.001);与cis-UCA相比,trans-UCA对急性淋巴细胞白血病(ALL)的危险度分级诊断更有价值。结论 HPLC方法可以测定血清UCA浓度,儿童急性白血病血清中的UCA浓度可为诊断与预后提供线索,具有重要临床意义。

发育相关基因在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达及意义

目的:探讨发育相关基因在儿童急性淋巴细胞白血病(Acutelymphoblasticleukemia,ALL)患者中的表达及其与临床特征的关系。方法:采用实时荧光定量RT-PCR方法检测125例初发ALL患儿(ALL组)骨髓样本中Notch1、Wnt3a和β-catenin的mRNA表达量,并与临床特征进行相关分析。对照组(Normalcontrol,NC)为20例非恶性血液病且骨髓正常患儿。结果:Notch1、Wnt3a和β-catenin的mRNA在ALL患儿和对照组患儿骨髓中均有表达。与对照组相比,ALL组中Notch1mRNA表达水平均明显降低(P<0.05),β-catenin mRNA表达水平明显增高(P<0.05),而Wnt3a的表达与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。Notch1的表达在T淋巴细胞白血病组高于对照组(P<0.05),而在B淋巴细胞白血病组则低于对照组(P<0.05);此外,β-catenin的表达与患儿高危年龄(<1岁或>10岁)及外周血高白细胞数(≥50×109个/L)等临床特征相关(P<0.05),与性别、FAB(Franch-American-Britain,FAB)分型、免疫分型及临床危险分级无关(P>0.05)。结论:儿童ALL患者中Notch1和β-catenin的表达异常,提示其可能与儿童ALL的发生发展存在密切的关系;β-catenin基因的高表达可能提示预后不良。Notch1和β-catenin基因检测,有望成为ALL诊断和治疗的新靶点。

白血病细胞中Beta-Arrestin1与EZH2分子结合研究

目的:检测急性淋巴细胞白血病细胞(acute lymphoblastic leukemia,ALL)CCRF-CEM和Raji细胞中Beta-抑制蛋白1(Beta-Arrestin1)与Zeste增强子同源物-2蛋白(enhancer of Zeste homolog 2,EZH2)是否存在结合。方法:白血病细胞中,Western blot检测Beta-Arrestin1与EZH2表达水平,激光共聚焦(Confocal)检测Beta-Arrestin1与EZH2在细胞中的位置与共定位;免疫共沉淀(CO-IP)检测Beta-Arrestin1与EZH2结合能力。结果:Beta-Arrestin1与EZH2在白血病K562、CCRF-CEM和Raji细胞中均有表达。激光共聚焦结果显示Beta-Arrestin1与EZH2均在K562、CCRF-CEM和Raji细胞内共定位,CO-IP结果显示在K562,CCRF-CEM和Raji细胞中Beta-Arrestin1与EZH2结合。结论:在CCRF-CEM和Raji中,Beta-Arrestin1可与EZH2结合。

β酮硫解酶缺乏症5例临床表型与基因型特征分析

目的总结β酮硫解酶缺乏症(BKTD)患儿的临床表型及基因变异特点。方法回顾性分析2018年10月至2022年12月在重庆医科大学附属儿童医院诊断及随访的5例BKTD患儿的临床特征,血液生化指标、血和尿质谱检测结果及ACAT1基因变异数据。结果5例BKTD患儿中男4例、女1例,首次发病年龄为9.7~28.0月龄。急性期均表现出严重代谢性酸中毒,pH值为6.9~7.1,血糖2.3~3.4 mmol/L,尿酮体阳性(+~++++)。血串联质谱分析提示甲基巴豆酰基肉碱、甲基丙二酰基肉碱与丙二酰基肉碱明显升高,分别为0.03~0.42、0.34~1.43及0.83~3.53µmol/L,尿气相色谱质谱检测提示2-甲基-3羟基丁酸、3-羟基丁酸明显升高,伴甲基巴豆酰甘氨酸轻度升高,分别为22~202、4~6066和0~29,但经过治疗后血和尿质谱代谢产物明显降低。5例患儿ACAT1基因错义变异比例8/9,发现4种未报道变异:c.678G>T(p.Trp226Cys)、c.302A>G(p.Gln101Arg)、c.627_629dupTGA(p.Asn209_Glu210insAsp)、c.316C>T(p.Gln106Ter),前2种变异经过SIFT、PolyPhen-2和Mutation Taster软件预测为有害,c.316C>T(p.Glu106Ter)为终止变异。结论BKTD相对罕见,缺乏特异性临床表现,急性发病期常出现严重代谢性酸中毒、低血糖及酮症,ACAT1基因错义变异为BKTD的主要遗传学病因。

转录因子SP1对急性T淋巴细胞白血病进程的影响

目的:研究转录因子SP1对支架蛋白ARRB1的转录调节及其在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)中的作用。方法:构建p GL3-ARRB1-luc、p CDNA3.1-SP1及其他可能结合的转录因子质粒,采用双荧光素酶报告基因实验证明ARRB1启动子区与转录因子结合;利用慢病毒感染构建SP1过表达的稳定细胞株JK-SP1,RT-PCR及Western blot验证SP1与ARRB1表达的关系;进一步流式细胞术检测SP1对细胞凋亡、细胞周期以及细胞活性氧含量的作用。构建NCG小鼠异种移植模型,探讨SP1对白血病小鼠成模能力的影响。结果:p GL3-ARRB1-luc、p CDNA3.1-SP1质粒共转入HEK293T细胞后,虫荧光素高表达(P<0.001);同时,与对照组相比,稳定细胞株JK-SP1中ARRB1 m RNA水平、蛋白水平均增加(均P<0.01)。进一步体外实验结果显示,与对照组相比,JK-SP1细胞凋亡比例更高(x=22.78%),细胞周期多阻滞于G1期(63.00%),活性氧含量增加。体内实验证明,尾静脉输注JK-SP1细胞的NCG小鼠生存时间更长(平均33.8 d),肝脾肿瘤细胞浸润相对较少。结论:转录因子SP1通过直接结合于ARRB1启动子区,促进ARRB1转录与表达,进而延缓体内、体外T-ALL疾病进程。本研究完善了ARRB1调控T-ALL进程的机制并为新的靶向药物研发提供了理论依据。

磷脂酶C通过抑制T-ALL细胞凋亡发挥促癌作用

目的:探讨磷脂酶C(PLC)家族各成员在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)进展中的作用。方法:泛PLC抑制剂U73122和Edelfosine处理T-ALL细胞,AnnexinV-PE/7-AAD双染法检测细胞凋亡。Cox回归和Kaplan-Meier法分析PLC蛋白对T-ALL患者无事件生存率(EFS)的影响。单因素方差分析PLC在各亚型T-ALL中的表达。构建PLCβ1、PLCγ1、PLCη1siRNA逆转录质粒,HEK-293T细胞包装逆转录病毒感染T-ALL细胞。利用RT-PCR和Westernblot检测基因表达。结果:4种T-ALL细胞系中,P12-ICH和CCRF-CEM对U73122和Edelfosine敏感,Jurkat和MOLT4对其耐药。TARGET-ALL数据库中,PLCβ1、PLCγ1、PLCη1高表达T-ALL患者预后不良,PLCβ1、PLCγ1、PLCη1在T-ALL各亚型中分布不均。在P12-ICH和CCRF-CEM中,PLCβ1、PLCγ1和PLCη1分别维持白血病细胞生存,而在MOLT4中,PLCβ1、PLCγ1和PLCη1对细胞生存无影响。结论:PLCβ1、PLCγ1和PLCη1能维持T-ALL细胞株体外生长,促进T-ALL恶性进展,是潜在的治疗靶点。