hsa＿circ＿0004123绝对定量PCR方法的建立及验证

目的建立能精确定量hsa_circ_0004123的绝对反转录荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,并在白血病细胞系中验证hsa_circ_0004123的拷贝数。方法提取B淋巴母细胞系HMy2.CIR总RNA,反转录合成cDNA。以cDNA为模板,扩增包含hsa_circ_0004123反向剪接位点的236 bp特征片段,克隆到pGM-T载体中,并对重组质粒进行测序鉴定。以梯度稀释的重组质粒为标准品,采用SYBR荧光染料法进行RT-qPCR并建立标准曲线,在4种白血病细胞系(HMy2.CIR、Jurkat、Raji、K562)中验证hsa_circ_0004123的拷贝数。结果建立了能精确定量hsa_circ_0004123拷贝数的绝对RT-qPCR方法,其线性范围为(9.63×10^3~9.63×10^9)拷贝/μl,灵敏度为(4528±516)拷贝/μl,批内变异系数(CV)为0.30%~1.86%,批间CV为1.40%~2.30%,且熔解曲线为单一峰值曲线。对4种白血病细胞系(HMy2.CIR、Jurkat、Raji、K562)中hsa_circ_0004123的拷贝数分别用本法进行检测,结果显示,hsa_circ_0004123在4种白血病细胞系中的表达差异有统计学意义(P<0.001)。结论建立的检测hsa_circ_0004123的绝对RT-qPCR方法具有线性范围广,灵敏度、特异性高,重复性好等特点,可为hsa_circ_0004123在白血病中的精确定量提供技术支持。