分泌性卷曲相关蛋白3影响小鼠胚胎肝干细胞体外成熟分化的实验研究

目的检测不同发育阶段的肝组织中Wnt信号拮抗因子分泌性卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related pro-tein,SFRP)的表达,并探讨SFRP3对胚胎肝干细胞体外成熟分化的影响。方法分离胚胎12.5 d至出生后4周共9个阶段的小鼠肝组织,RT-PCR检测5种SFRPs在肝组织及胚胎肝干细胞14.5(embryonic liver stem cells,ELSC)中的表达水平。腺病毒SFRP3感染小鼠胚胎肝干细胞,地塞米松(dexamethasone,Dex)联合肝细胞生长因子(hepatic growthfactor,HGF)诱导肝细胞分化,诱导后第3、6、9、12天检测白蛋白启动子荧光素酶报告基因(ablumin promoter-GaussiaLuciferase,ALB-GLuc)活性,诱导后第12天,RT-PCR和Western blot检测肝脏相关基因表达,PAS染色检测糖原合成功能。结果 SFRP1、4、5在不同阶段肝组织中的表达无明显差异,SFRP2和SFRP3只在胚胎期肝组织中表达,随后很快消失。ELSC14.5细胞中,SFRP2高表达而SFRP3表达很低。Dex联合HGF可有效诱导ELSC14.5细胞的体外成熟分化,与对照组相比,SFRP3过表达可降低成熟肝细胞标志白蛋白(albumin,ALB)、细胞角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)、酪氨酸转氨酶(tyrosine aminotransferase,TAT)、载脂蛋白B(apolipoprotein B,ApoB)及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A(UDP-glucuronosyl transferase,UGT1A)的水平,增强肝干细胞标志Delta蛋白(Delta-like protein,DLK)和甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)的表达,并抑制糖原合成功能。结论 SPRF3在肝脏发育过程中表达水平迅速降低,并显著抑制胚胎来源的肝干细胞体外成熟分化,其下调可能是肝脏发育和肝细胞成熟分化的一个重要因素。

肝细胞生长因子促进骨形态发生蛋白9诱导小鼠骨髓间充质干细胞C3H10成骨分化的研究

目的探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)联合骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导小鼠骨髓间充质干细胞(C3H10)成骨分化的影响,并探讨其可能的分子机制。方法用重组腺病毒介导BMP9在C3H10细胞中过表达,同时联用20 ng/m L肝细胞生长因子HGF诱导C3H10细胞,Real-time PCR检测C3H10成骨分化相关基因骨钙蛋白(osteocalcin,OC)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因mRNA水平的表达变化;Western blot检测OC、OPN的蛋白表达水平;ALP染色及ALP读数分析C3H10细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的变化;茜素红S染色检测细胞的钙盐沉积;Real-time PCR检测经典信号通路Smad1/5/8在此诱导过程中的表达水平。结果 BMP9单独作用能诱导C3H10细胞向成骨方向分化,并增强细胞ALP活性,单独HGF有较弱的成骨诱导作用,但与BMP9联用可显著增强C3H10细胞成骨特异性标志物OC与OPN的mRNA及蛋白表达水平(P<0.05),促进ALP活性,及晚期的钙盐沉积;HGF能刺激Smad1/5/8信号通路mRNA表达水平显著增高(P<0.05)。结论肝细胞生长因子可显著增强BMP9诱导C3H10细胞成骨分化的作用,可能是通过激活Smad经典信号通路来实现的。

不同Wnt信号分子对胚胎肝干细胞分化的影响研究

目的探讨不同Wnt蛋白对小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19分化的作用,筛选有效的肝干细胞定向分化体系,为治疗肝衰竭提供理论基础。方法携带不同Wnt蛋白基因的19种重组腺病毒,分别感染HP14-19,检测清蛋白启动子启动的荧光素酶报告基因活性;实时荧光定量PCR检测detla蛋白DLK、甲胎蛋白(AFP)、清蛋白(ALB)、上皮特异性标志物细胞角蛋白(CK18)等肝细胞分化成熟相关标志物的表达情况;糖原(PAS)染色实验和吲哚菁绿(ICG)摄取实验用于检测肝细胞合成代谢功能。结果19种Wnt腺病毒均能有效感染HP14-19细胞并表达相应的Wnt信号蛋白,随着处理时间的延长,荧光素酶值逐渐升高,其中Wnt3a的作用最明显;Ad-Wnt3a组肝干细胞标志DLK、AFP表达明显下降;肝细胞特异性成熟标志ALB、CK18明显上调;Ad-Wnt3a处理后PAS染色可见70%~80%的细胞染色阳性,细胞由多角形变为长梭形;ICG摄取实验可见大量绿色圆形或者多边形阳性细胞。结论Wnt3a蛋白是诱导HP14-19细胞成熟分化的重要蛋白,诱导分化后的细胞类似于成熟肝细胞,有较强的合成代谢功能;对进一步研究肝干细胞分化调控及肝移植应用有重要意义。

TNF-α、TGF-β_1在胆汁淤积性肝硬化中平衡调控肝脏干细胞分化

目的探讨TNF-α、TGF-β_1在胆汁淤积性肝硬化中的变化及其对肝脏干细胞分化平衡的影响。方法 Balb/c小鼠行胆总管结扎术,血生化指标和肝脏HE染色评价造模情况;免疫组织化学和蛋白印迹检测造模后TNF-α、TGF-β_1的变化;以小鼠胚胎肝脏干细胞HP14-19为研究对象,TNF-α、TGF-β_1分不同浓度干预,蛋白印迹、Real-time PCR、PAS染色评价分化情况。结果胆总管结扎组中血生化指标明显升高(P<0.05),HE染色见胶原纤维增多,TNF-α、TGF-β_1表达高于假手术组(P<0.05);TNF-α、TGF-β_1诱导分化3 d后,其分化情况与对照组相比,无明显差别;诱导分化5 d后,TNF-α、TGF-β_1各浓度组的PAS染色强于对照组,TNF-α20、40、80 ng/mL浓度组的细胞角蛋白18(ck18)明显高于细胞角蛋白19(ck19)(P<0.05),而TGFβ_1则相反,20、40、80 ng/mL浓度组的ck19高于ck18(P<0.05);诱导分化10 d后,TNF-α、TGF-β_1促分化的趋势与诱导5 d时相同,且蛋白印迹、PAS染色更强,但Real-time PCR表达更低。结论胆总管结扎术能成功模拟胆汁淤积性肝硬化,TNF-α、TGF-β_1在该疾病中表达均增加,但它们对于肝脏干细胞的分化平衡发挥着相互制约的作用:前者主要促进肝脏干细胞向肝细胞分化,而后者则主要促进其向胆管细胞分化。

β-catenin基因对脊髓源性神经干细胞分化的作用

目的探讨β-catenin基因对脊髓源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化的作用。方法分离E14胎鼠脊髓组织,单细胞克隆技术对其分离细胞扩增培养,免疫荧光对细胞进行鉴定。实验分为3组:单独培养的NSCs(空白组)、感染空载Ad GFP腺病毒的NSCs(GFP组)、感染Adβ-catenin腺病毒的NSCs(β-catenin组)。荧光显微镜观察细胞感染效率,RT-PCR检测神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)mRNA表达,免疫荧光检测神经元核蛋白(Neu N)、GFAP的表达及定位,Western blot检测Neu N、GFAP的表达。结果胎鼠脊髓组织分离的细胞具有连续分化及克隆能力,形成少量细胞团,机械分离后细胞呈不规则球形;早期分离的大部分细胞Nestin抗原呈阳性;NSE mRNA在β-catenin组显著高于空白组及GFP组,GFAP mRNA表达均低于其他两组(P<0.05);免疫荧光显示β-catenin组Neu N的表达水平显著高于空白组及GFP组(P<0.05),主要定位于细胞核中,GFAP的表达相对较低(P<0.05);Western blot检测显示β-catenin组的Neu N表达显著高于空白组及GFP组,而GFAP的表达低于其他两组(P<0.05)。结论β-catenin可促进脊髓源性NSCs向神经元分化。

骨形态发生蛋白-2、-3对胚胎小鼠椎间盘细胞的成软骨及成骨作用

目的探索成骨作用的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)及抑制成骨作用的骨形态发生蛋白-3(BMP-3)对胚胎小鼠椎间盘细胞的成软骨及成骨作用,为BMPs临床治疗椎间盘相关疾病提供实验依据。方法运用腺病毒介导的BMP-2和BMP-3在胚胎小鼠椎间盘细胞中表达,RT-PCR检测Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)、蛋白多糖(ACAN)、骨钙素(OC)、骨保护素(OPG)和骨桥蛋白(OPN)成软骨及成骨相关指标mRNA水平的表达,甲苯胺蓝染色检测软骨基质的表达,碱性磷酸酶(ALP)读数及ALP染色检测ALP的活性。结果 BMP-2和BMP-3表达对于椎间盘纤维环(AF)细胞的成软骨和成骨均没有作用。对椎间盘髓核(NP)细胞的软骨相关指标ColⅠ、ColⅡ、ACAN mRNA的表达同样没有影响,但可促进NP细胞的成骨,其中BMP-2和BMP-3均可促进OC mRNA的表达升高,而仅BMP-2可促进其OPG和OPN的mRNA表达升高。甲苯胺蓝染色证明BMP-2和BMP-3对椎间盘细胞软骨基质分泌的影响并不显著。NP细胞在BMP-2和BMP-3腺病毒感染后ALP活性明显增强,在AF细胞中则未观察到这种变化。结论 BMP-2和BMP-3均可促进胚胎小鼠NP细胞的成骨作用,但对AF细胞的成骨及成软骨作用及对NP细胞的成软骨作用没有影响。

骨形态发生蛋白-7对胚胎小鼠髓核细胞成骨分化和Notch信号表达的影响

目的:探索骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)诱导胚胎小鼠椎间盘髓核细胞(nucleus pulposus,NP)的成骨分化及对经典Notch信号通路的调控作用。方法:重组腺病毒BMP-7(recombinant adenovirus-mediated bone morphogenetic protein-7,Ad-BMP-7)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,Ad-GFP)在HEK293细胞中扩增,感染NP细胞。实验分为BMP-7组(n=3)、GFP组(n=3)、空白组(n=3)。RT-PCR检测BMP-7的m RNA水平表达;Real-time PCR检测成骨指标骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)以及经典Notch信号通路分子的m RNA表达水平;Western blot检测成骨转录因子Runx2和OPN的蛋白表达水平;采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)读数和ALP染色检测ALP活性。结果:Ad-BMP-7和Ad-GFP在HEK293细胞中高滴度的扩增。NP细胞中BMP-7的基础表达很低,Ad-BMP-7感染NP细胞可高表达BMP-7,并明显提高OPN、OPG的m RNA水平表达(OPN:BMP-7组21.16±0.45,GFP组1.00±0.07,空白组2.84±1.27,F=613.815,P=0.000,BMP-7组与GFP组、空白组比较均P=0.000;OPG:BMP-7组2.05±0.37,GFP组1.00±0.06,空白组1.22±0.36,F=10.046,P=0.012,BMP-7组与GFP组比较P=0.016,与空白组比较P=0.047),成骨转录因子Runx2及OPN的蛋白表达水平也均高于对照组,特异性成骨指标ALP的活性明显增强,ALP染色呈紫蓝色,明显高于对照组(BMP-7组222 676.8±7 643.2,GFP组31 455.5±4 930.6,空白组42 407.3±10 926.8,F=513.417,P=0.000,BMP-7组与GFP组、空白组比较均P=0.000)。AdBMP-7感染3 d可促进Notch信号通路Notch-1、Notch-2、Jag-1、Hey-1的m RNA水平表达增高(Notch-1:BMP-7组5.90±0.66,GFP组2.83±0.32,空白组1.00±0.05,F=94.574,P=0.002,BMP-7组与GFP组比较P=0.003,与空白组比较P=0.004;Notch-2:BMP-7组150.35±11.78,GFP组1.94±0.46,空白组1.01±0.19,F=318.962,P=0.001,BMP-7组与GFP组、空白组比较均P=0.000;Jag-1:BMP-7组7.97±0.00,GFP组2.22±0.71,空白组1.00±0.00,F=166.476,P=0.001,BMP-7组与GFP、空白组比较均P=0.000;Hey-1:BMP-7组11.23±0.4,GFP组0.42±0.04,空白组1.00±0.10,F=1 082.054,P=0.000,BMP-7组与GFP组、空白组比较均P=0.000),但第7天回复到基础表达水平,其余信号分子表达无明显差异。结论:腺病毒介导的BMP-7可诱导NP细胞成骨分化,可能与Notch信号通路部分分子的一过性上调相关。

壳聚糖和油酸钠修饰的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的细胞毒性

目的 研究壳聚糖和油酸钠修饰的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子（superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs）的细胞毒性，为临床应用提供实验依据。方法 用透射电子显微镜对壳聚糖SPIONs和油酸钠SPIONs进行形态学观察；用10 μg/mL的壳聚糖SPIONs和油酸钠SPIONs悬液处理体外培养的人肺腺癌细胞A549，普鲁士蓝染色观察2种SPIONs在细胞内的分布；用不同浓度（0、25、50、100和200 μg/mL）的2种SPIONs分别处理A549细胞，MTT法测定细胞生长活性；2种SPIONs染毒A549细胞48 h时，测定上清液中乳酸脱氢酶（LDH）的活性；DAPI染色法观察细胞凋亡情况。结果 （1）2种SPIONs均呈类球形结晶，粒径20~30 nm，此时四氧化三铁纳米粒子之间的热振动能足以克服磁吸引力而呈现超顺磁性。（2）普鲁士蓝染色显示细胞内可见蓝色沉着，说明2种SPIONs均可进入A549细胞内。（3）MTT检测结果显示壳聚糖SPIONs对细胞生长几乎无抑制，而200 μg/mL 油酸钠SPIONs在48 h和72 h时对细胞有明显的抑制作用（P〈0.05）。（4）200 μg/mL壳聚糖SPIONs染毒细胞的上清液中LDH活性稍高于对照组（P〈0.05），而100 μg/mL和200 μg/mL油酸钠SPIONs染毒细胞的上清液中LDH活性均高于对照组（P〈0.05），同时也高于相同浓度壳聚糖SPIONs染毒组（P〈0.05）。（5）DAPI凋亡检测显示，壳聚糖SPIONs染毒细胞与对照组间差异无统计学意义，而油酸钠SPIONs染毒细胞发生明显的细胞核皱缩及胞核碎裂现象，且细胞凋亡率高于对照组（P〈0.05）。结论 壳聚糖SPIONs与油酸钠SPIONs相比具有较低的细胞毒性。

β-catenin过表达对骨肉瘤细胞TE85迁移、侵袭及凋亡的影响

目的探讨β-catenin对骨肉瘤细胞TE85迁移、侵袭及凋亡的影响。方法 RT-PCR及Western blot检测β-catenin在不同骨肉瘤细胞中的表达情况,重组腺病毒Adβ-catenin感染TE85细胞,RT-PCR及荧光素酶报告基因检测感染Adβ-catenin后β-catenin mRNA的表达及活性,划痕实验检测迁移能力,Transwell实验检测侵袭能力,DAPI染色和流式细胞技术检测细胞凋亡情况。结果 TE85细胞内源性β-catenin表达相对较低(P<0.05),Adβ-catenin能显著增加TE85细胞外源性β-catenin基因表达及活性,β-catenin组细胞迁移能力明显减慢(P<0.05),β-catenin组侵袭能力明显低于对照组(P<0.05)。结论β-catenin能抑制肿瘤细胞TE85的迁移及侵袭能力,对凋亡无影响。

骨修复用左旋聚乳酸-β-磷酸三钙复合多孔支架的制备及性能研究

目的:通过调节左旋聚乳酸(Poly(L-lactic acid),PLLA)/β-磷酸三钙(beta-tricalcium phosphate,β-TCP)复合多孔支架中β-TCP的比例,制备出一种可生物降解、具有一定强度及骨引导性、细胞相容性及生物相容性良好的支架。方法:采用溶剂自扩散-模压成型——盐沥滤、冷冻干燥法制备了β-TCP含量分别为0、10%、20%、30%、40%、50%的PLLA/β-TCP复合多孔支架。用扫面电镜观测不同β-TCP含量的复合多孔支架的微观形貌,用量重法测量其孔隙率,用动静态疲劳试验机检测各组复合多孔支架的力学强度。各组复合多孔支架接种相同量的骨髓间充质干细胞培养3 d后固定,用扫描电镜观察多孔支架爬行细胞的数量以评价骨支架的细胞相容性。用各组骨支架浸提液培养骨髓间充质干细胞,分别于细胞培养第1天、第3天、第5天及第7天规定时间点用CCK8测试盒检测各组细胞的吸光度以评价骨支架的生物相容性。结果:纯左旋聚乳酸为疏水性材料,不利于细胞的粘附生长;PLLA/β-TCP复合多孔支架表面粗糙,β-TCP的引入可以改善支架材料的亲水性及骨引导性,有利于细胞的爬行生长,其中β-TCP含量为30%(P/T30)组支架细胞接种面扫描电镜下观察细胞爬行生长的数量最多;β-TCP的掺入可使复合支架的X线显影良好,可为支架植入体内降解的体外摄片评估提供方便;PLLA/β-TCP复合支架具备良好的细胞相容性及生物相容性。结论:通过溶剂自扩散-模压成型--盐沥滤、冷冻干燥法制备的PLLA/β-TCP复合支架孔隙较丰富、具备一定的强度,细胞相容性及生物相容性良好,有望通过调节其组分而得到一种降解可调的理想的组织工程骨支架。

糖尿病肾病患者尿源性干细胞的分离鉴定及与健康人尿源性干细胞的细胞生物学比较研究

干细胞移植是糖尿病肾病新的治疗途径,但异种干细胞存在伦理及免疫排斥等问题。该研究从糖尿病肾病患者尿液中提取出一种类似干细胞的细胞,称之为糖尿病病人尿源性干细胞(USCs from patients with diabetic nephropathy,D-USCs),并比较了与健康人尿源性干细胞(urine derived stem cells,USCs)生物学特性的差异。通过观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物,茜素红及油红O染色分别检测成骨和成脂分化潜能,以鉴定其干细胞特性。通过绘制生长曲线比较D-USCs与USCs增殖能力,人促血管生成因子检测试剂盒检测细胞外分泌因子的表达情况,流式细胞术检测细胞凋亡率的差异。结果表明,此类细胞可以在体外分离培养,连续传代生长,细胞形态保持米粒状,表达间充质干细胞标志物(包括CD 24、CD 29、CD 73、CD 90、CD 105)、周细胞标志物(CD 146),不表达造血干细胞标志物(包括CD 31、CD 34、CD 45),具有成骨和成脂分化的潜能。与USCs相比,D-USCs的增殖能力受到损伤,分泌因子种类基本保持一致,但数量上有所减少,细胞凋亡率升高。综上所述,该研究成功从糖尿病肾病病人尿液中提取出尿源性干细胞,为干细胞移植治疗肾损害提供了可能的新的细胞来源,避免了异体免疫排斥反应。

β-catenin对骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨经典Wnt信号通路关键节点β-catenin对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的影响。方法用重组腺病毒介导BMP9在C3H10T1/2细胞中过表达,联用β-catenin重组腺病毒上调β-catenin的表达,并通过RNA干扰抑制β-catenin的表达。分析C3H10T1/2细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的变化;RT-PCR检测细胞成骨分化相关基因骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨钙蛋白(osteocalcin,OC)基因mRNA的转录水平;茜素红S染色检测细胞的钙盐沉积。结果 BMP9单独作用能诱导C3H10T1/2细胞向成骨方向分化,并增强细胞ALP活性;单独的β-catenin无成骨诱导作用,但可剂量依赖性地增强BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性,并促进BMP9诱导的细胞OPN和OC基因mRNA的转录水平及钙盐沉积;抑制β-catenin表达可显著降低BMP9诱导的C3H1OT1/2细胞的ALP活性(P<0.05),下调OPN和OC基因mRNA的转录水平,并抑制钙盐沉积。结论经典Wnt信号通路可能通过β-catenin协同BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化,且BMP9诱导的成骨分化可能需要通过Wnt/β-catenin途径来实现。

胆汁淤积性肝硬化来源的微环境因子对肝脏干细胞分化的影响

该研究探讨了胆汁淤积性肝硬化病理微环境来源的细胞因子在胆总管结扎小鼠不同时间点的表达变化,且在体外致力寻找最优的细胞因子组合高效诱导肝脏干细胞HP14-19分化为成熟肝细胞。以Balb/c小鼠胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)模拟胆汁淤积性肝硬化病理微环境;免疫组织化学检测胆总管结扎小鼠肝组织中细胞因子EGF、HGF及TGF-α的表达;以小鼠胚胎肝干细胞HP14-19细胞为研究对象,以不同浓度在不同时间点进行荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc活性;qRT-PCR、Western blot检测肝细胞相关标志物表达;吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)及过碘酸–希夫(periodicacid-schiff,PAS)染色检测肝细胞的成熟功能。结果显示,小鼠胆总管结扎能成功模拟胆汁淤积性肝硬化,并随结扎时间延长肝硬化程度加重;与对照相比,在EGF(10 ng/mL)、HGF(20 ng/mL)、TGF-α(20 ng/mL)单独诱导HP14-19细胞能有效增强ALB-Gluc活性(P<0.05);且在EGF(10 ng/mL)、HGF(20 ng/mL)、TGF-α(20 ng/mL)联合诱导HP14-19细胞时显著增强ALBGluc活性(P<0.05);qRT-PCR、Western-blot显示,ALB、CK18表达随时间增加而增加,而AFP表达则相反。ICG摄取及PAS染色阳性细胞数显著增加(P<0.05)。因此,胆汁淤积性肝硬化病理微环境来源的细胞因子能有效促进肝脏干细胞肝向分化,将对细胞因子联合肝脏干细胞移植治疗胆汁淤积性肝硬化有一定的指导意义。

高表达CXCR4/CXCR7对小鼠胚胎肝干细胞增殖、迁移和抗氧化应激损伤的影响

该研究探讨了基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)/趋化性细胞因子受体4(chemotaxis cytokine receptor 4,CXCR4)和SDF-1/趋化性细胞因子受体7(CXCR7)对小鼠胚胎肝干细胞14-19(HP14-19)增殖、迁移和抗氧化应激损伤的影响。重组腺病毒Ad-CXCR4和Ad-CXCR7感染HP14-19细胞,流式细胞术和Western blot检测细胞膜上CXCR4/CXCR7受体的表达;MTT法检测细胞增殖;Transwell法检测细胞迁移;过氧化氢(H2O2)处理细胞,建立氧化应激损伤模型,MTT法检测细胞活力;酶学法检测乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性。结果显示,感染腺病毒Ad-CXCR4/CXCR7后,HP14-19细胞膜CXCR4/CXCR7受体水平显著上调;高表达CXCR7可增强细胞增殖活性,而高表达CXCR4对细胞增殖活性无显著效果;高表达CXCR4或CXCR7可显著增强SDF-1诱导的HP14-19细胞的迁移和氧化应激状态下的细胞存活率,其中,CXCR7对迁移效应较强;与对照组比较,高表达CXCR4或CXCR7可降低H2O2造成的细胞LDH活性,增强SOD活性。因此,CXCR4参与了SDF-1诱导的HP14-19细胞增殖作用,且CXCR4/CXCR7介导SDF-1诱导HP14-19细胞的迁移和抗氧化应激损伤作用。

超顺磁性壳聚糖质粒明胶控释微球促进人工骨内新生血管的实验研究

目的 提出并利用人工骨支架内部的磁性微动、营养物质交换原理,解决大段骨缺损人工骨内部血管化的问题.方法 取48只成年新西兰兔按数字随机表法随机分成4组,手术制成96侧桡骨骨缺损模型.A组：超顺磁性壳聚糖质粒明胶微球（SPCPGM＋静磁场＋振荡磁场）;B组：超顺磁性壳聚糖质粒明胶微球（SPCPGM＋静磁场）;C组：超顺磁性壳聚糖质粒明胶微球（SPCPGM）;D组：对照组,壳聚糖质粒明胶微球（CPGM）;通过大体观察、墨汁灌注、HE染色、免疫组化等评价其血管化效果.结果 纳米Fe3O4微粒呈球形,外形规则且表面光滑,粒径主要分布于50 nm左右,当氮磷比（N/P）达1∶0.6时,SPFCN能与质粒完全结合;A组新生组织出现最早,4～6周即形成成熟的血管网,且数量明显多于其他处理组,同时期残留的微球少于其他组;B组成血管过程与A组相似,成血管的时间迟于A组约两周左右;C、D组成血管时间晚于B组,同时期残留未降解的微球相对较多.结论 Fe3O微粒为超顺磁性纳米粒,且能够有效地与质粒结合;超顺磁性质粒（pDsVEGF165Red1-N1）壳聚糖明胶微球具有促进生物活性人工骨成血管的作用;静磁场和振动磁场联合应用,能够明显提高超顺磁性质粒壳聚糖明胶微球局部成血管作用;振荡磁场能够有效地减少局部磁性微球的残留.

全反式维甲酸促进骨形态发生蛋白9诱导肝祖细胞成熟分化的作用研究

该文研究了全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)促进骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导肝祖细胞14-19(hepatic progenitor cell 14-19,HP14-19)成熟分化的作用。重组腺病毒Ad-BMP9和ATRA单独及联合作用诱导肝祖细胞HP14-19成熟分化,荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc表达情况,Real-time PCR检测肝脏相关基因DLK、AFP、ALB和TAT的mRNA水平,Western blot及免疫荧光检测AFP、ALB、CK18和UGT1A蛋白质水平,PAS染色和ICG摄取实验检测成熟分化后的功能。Ad-BMP9组和ATRA组的ALB-Gluc活性较对照组增高,而AdBMP9+ATRA组ALB-Gluc活性又显著高于Ad-BMP9组和ATRA组。Ad-BMP9+ATRA组的ALB和TAT mRNA水平以及ALB、CK18和UGT1A蛋白质水平均高于Ad-BMP9组和ATRA组,但肝干细胞标志DLK、AFP的表达均降低(P<0.05)。Ad-BMP9+ATRA组的ICG摄取及PAS染色阳性细胞数显著高于Ad-BMP9组和ATRA组。ATRA和Ad-BMP9均诱导肝祖细胞HP14-19成熟分化,联合作用强于单独作用。

骨形成蛋白信号分子在小鼠椎间盘发育中的表达

目的：探索促进成骨相关的骨形成蛋白（BMP）-2、-4、-6、-7、-9以及抑制成骨作用的BMP-3在小鼠不同年龄段椎间盘中表达情况，为椎间盘发育过程中BMP信号途径的研究奠定重要基础。方法：解剖获取出生后1d、3d、1周、1个月、3个月、6个月龄小鼠的椎间盘及胸腰椎脊柱。RT-PCR检测BMP-2、-3、-4、-6、-7、-9在生后不同年龄段小鼠椎间盘的表达情况，免疫印迹及免疫组织化学验证在RT—PCR中有明显表达差异的BMP-3、-6。结果：RT-PCR结果显示BMP-2、-7、-9的表达在小鼠椎间盘组织中有一定的基础表达，但随着年龄增大没有明显的变化趋势，而BMP-3和BMP-6的表达整体呈现出下降的趋势，BMP-4在椎间盘中无表达，免疫印迹及免疫组织化学结果也证实BMP-3和BMP-6随着小鼠椎间盘的发育表达降低。结论：正常小鼠脊柱，随着年龄的增加，椎间盘中BMP-2、-7、-9的表达无明显变化趋势，各年龄段都维持着一定量的表达，BMP-3和BMP-6的表达整体呈现出下降的趋势，具有明显成骨作用的BMP-4则没有表达。

3-D多孔结构的小肠黏膜下组织在兔膀胱再生中的应用

目的探讨3-D多孔结构的小肠黏膜下组织(small intestine submucosa,SIS)在新西兰大白兔膀胱再生中的应用。方法用物理及化学方法制备具有3-D多孔结构的SIS。将24只雄性新西兰大白兔随机分为3组(n=8),分别行膀胱半切术建立膀胱缺损模型,使用3种不同处理的SIS进行膀胱重建。A组:未经过氧乙酸(peroxyacetic acid,PAA)处理的SIS组;B组:PAA处理的SIS组;C组:PAA处理后100%胎牛血清浸润的SIS组。3组在术前及术后4周测定膀胱容量,并于术后4周取材,行大体观察及组织学检测,评估膀胱再生情况。结果应用SIS行兔膀胱重建术后4周,3组再生膀胱组织与周围组织粘连依次降低,结石率分别为33.3%、28.6%、14.31%。与术前自身比较,术后4周3组膀胱最大容量均缩小且依次增加,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。术后组织学检测示3组膀胱上皮细胞均有再生,与A组比较,B、C组的上皮再生更好,边缘区和中心区无明显差异。3组膀胱平滑肌的再生均不理想,但边缘区平滑肌再生较中心区多;在边缘区和中心区,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。3组在边缘区和中心区的再生血管面积依次增加,3组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论经PPA及胎牛血清处理后3-D多孔结构的SIS,具有良好的促进膀胱组织再生能力,是一种比较理想的修复支架材料。

垂盆草苷对幼龄肝内胆汁淤积大鼠的作用机制

研究垂盆草苷(sarmentosin,SA)对幼龄肝内胆汁淤积大鼠的干预和调节作用。将48只SD幼龄大鼠随机分为正常组(Control)、α-萘异硫氰酸酯(ANIT)组(Model)、熊去氧胆酸(UDCA)阳性对照组、垂盆草苷低、中、高剂量组,每组8只,除正常组外,各组大鼠连续1周分别灌胃给予相应药物,每日1次。在第5 d灌胃给予80 mg/kg ANIT造模。在造模后48 h测定大鼠的胆汁流量;测定大鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的活性和总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总胆汁酸(TBA)的含量;检测肝脏组织病理变化和组织匀浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量;测定血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、γ-干扰素(INF-γ)、白细胞介素1β(IL-1β)的表达;Western blot法分析胆汁酸转运蛋白与合成蛋白。与正常组相比,模型组胆汁流量受到明显的抑制;大鼠肝组织出现明显的病理损伤;血清中ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA水平显著升高;组织匀浆中MDA含量显著升高,SOD和GSH-Px含量显著降低;炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表达升高(P<0.05,P<0.01);FXR、SHP-1、SHP-2、MREP2、BSEP、NTCP蛋白表达下降,CYP7A1、CYP27A1蛋白表达升高。与模型组相比,垂盆草苷各剂量组大鼠的胆汁流量呈现不同程度的增加;大鼠肝脏组织的病理损伤有所改善;血清中ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA水平降低;肝脏组织匀浆中MDA的含量降低,SOD、GSH-Px的含量升高(P<0.05,P<0.01);TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表达降低(P<0.05,P<0.01);结果表明垂盆草苷对于胆汁淤积有一定的治疗效果,其中垂盆草苷高剂量的作用效果与UDCA组相当,同时垂盆草苷可上调FXR、SHP-1、SHP-2、MREP2、BSEP、NTCP蛋白表达,下调CYP7A1、CYP27A1蛋白表达,说明垂盆草苷通过调控相关蛋白发挥作用。垂盆草苷对ANIT所致的SD幼龄大鼠肝内胆汁淤积有明显的干预和调节作用。可能是通过参与胆汁酸的转运与合成发挥其治疗作用。

胆总管结扎胆汁淤积性肝硬化动物模型的建立与评价

目的探讨胆总管结扎手术致胆汁淤积性肝硬化小鼠模型的建立价值,并对模型进行评价。方法将84只balb/c小鼠随机分为实验组(采用胆总管结扎术)和对照组(采用假手术),术后观察小鼠一般情况和肝胆大体结构;采用全自动生化分析仪检测术后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d总胆红素(total bilirubin,TBIL)、直接胆红素(direct bilirubin,DBIL)、谷氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST);采用H&E染色评估肝脏组织形态学变化;采用masson染色和免疫组织化学检测术后28 d小鼠肝脏组织切片,评估两组胶原纤维增生和a-SMA、CK-19蛋白表达情况。结果实验组与对照组小鼠相比,术后一般情况相对更差,胆汁淤积,胆囊、胆总管体积明显增大,各项血清生化指标明显增高(P<0.05);HE染色可见肝小叶结构改变,胆管增生;术后28 d实验组小鼠masson染色可见胶原纤维形成,免疫组织化学染色提示a-SMA、CK-19表达量显著增多(P<0.05)。结论经腹中线小切口行胆总管结扎手术可成功构建小鼠胆汁淤积性肝硬化模型。