重庆汉族儿童IL-18基因启动子-137G/C多态性及蛋白表达与结核病易感性的关系

目的:探讨重庆汉族儿童白介素-18(Interleukin18,IL-18)18基因启动子单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)与结核病易感性的关系及其对蛋白表达能力的影响。方法:序列特异性引物-聚合酶反应(Sequence specific primers-pdy merase chain reaotion,SSP-PCR)方法分析113名重庆汉族结核病患儿及167名健康儿童IL-18基因启动子(-607C/A和-137G/C)多态性;ELISA检测46例重庆汉族健康儿童PBMCs培养上清中IL-18的表达水平。结果:结核患儿组IL-18-137GG基因型的分布频率(81.4%)显著高于健康对照组(67.7%)(P=0.01),-137GC基因型的分布频率(16.8%)显著低于健康对照组(28.7%)(P=0.02);结核患儿组IL-18-137等位基因C分布频率(10.2%)明显低于健康对照(18.0%)(P=0.01);而结核患儿IL-18-607位各基因型及等位基因频率与健康对照比较无显著性差异。携带IL-18-137GG基因型儿童的PBMCs体外自发或经PMA+A23187活化后,表达IL-18蛋白的水平显著低于-137GC基因型者(P<0.01)。结论:IL-18-137位基因多态性可能与重庆儿童结核病易感性有关,等位基因G可能使IL-18蛋白低表达,是结核病的易感基因,而IL-18-607位基因多态性则可能与结核病易感性无关。

地塞米松和甲基泼尼松龙对哮喘儿童外周血Th1/Th2类细胞因子平衡的影响

目的 观察支气管哮喘儿童外周血单个核细胞 (PBMC)中CD4 +T细胞中两个功能性亚群 (Th1/Th2 )的功能状态及地塞米松和甲基泼尼松龙对其的影响。方法 15例哮喘及 14名健康儿童 ,取静脉血 ,密度梯度离心法分离PBMC ,分别用 10 -8mol/L地塞米松和甲基泼尼松龙体外干预培养 4 8h后 ,用ELISA法测定培养上清中的干扰素 γ(IFN γ)、白细胞介素 4 (IL 4 )和IL 10的浓度。结果 地塞米松和甲基泼尼松龙均可明显抑制哮喘儿童PBMC分泌IFN γ(P值分别为 0 .0 0 4和 0 .0 0 2 )和IL 4(P值分别为 0 .0 0 2和 0 .0 0 1) ;若以IFN γ/IL 4表示Th1/Th2间的平衡 ,则甲基泼尼松龙 (P <0 .0 5 )可恢复Th1/Th2平衡 ;地塞米松和甲基泼尼松龙都不影响IL 10的分泌。结论 地塞米松和甲基泼尼松龙均可抑制IFN γ和IL 4的产生 ,但甲基泼尼松龙抑制作用更强 。

核因子-κB介导危重新生儿免疫功能研究

目的观察危重新生儿危重状态下免疫功能改变及核因子-κB(NF-κB)在其中的作用。方法选择50例危重新生儿作为观察对象,25例健康新生儿作为健康对照组。抽取二组静脉血,分别检测其血IL-4、IFN-γ、TNF-α及NF-κB等免疫指标。结果与健康对照组比较,危重新生儿存在NF-κB活性增高及Th1及Th2平衡紊乱,IL-4及TNF-α显著升高,IFN-γ降低。结论危重新生儿存在免疫功能紊乱;NF-κB信号转导通路参与危重新生儿发病。

急性肾小球肾炎与肾病综合征患儿体液免疫指标比较

目的检测急性链球菌感染后肾小球肾炎与肾病综合征(NS)患儿体液免疫指标,进行比较、分析,以达到早期鉴别诊断、早期合理用药目的。方法对23例链球菌感染后肾小球肾炎、48例NS、正常对照18例儿童检测血IgG、IgA、IgM、C3、C4水平,采用英国MININEPH仪器及配套试剂,散射比浊法检测。IgE定量检测采用美国E&ELABSINC公司全套试剂盒,ASO采用免疫比浊法,血沉采用魏氏法检测。结果急性肾小球肾炎与正常对照组比较,IgG、IgA、IgE、C3、C4有显著性差异(Pa<0.05),ASO、血沉具有均明显升高(Pa<0.05)。NS与正常对照组比较,IgG、IgM、IgE具有显著性差异(Pa<0.05);急性肾小球肾炎与NS比较,IgG、IgA、C3、C4具有显著性差异(Pa<0.05),前者IgG、IgA明显升高,C3、C4明显降低,而后者IgG则明显降低。结论急性肾小球肾炎与NS患儿临床表现不典型者可通过检测血IgG、IgA、C3、C4水平加以鉴别,再辅以ASO、血沉检测,可达到早期诊断、早期治疗的目的。

卡介菌多糖核酸注射液和特异性免疫治疗对哮喘的疗效

目的研究卡介菌多糖核酸(BCG-PNA)和特异性免疫治疗(SIT)对哮喘患儿肺功能、血清IgE和分泌细胞因子的影响。方法用BCG-PNA和SIT治疗哮喘患儿45例,治疗前后检测肺功能,酶联免疫吸附试验检测血清IgE和外周血单个核细胞分泌细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-13、IL-12水平。结果BCG-PNA和SIT明显改善哮喘患儿的用力肺活量、第1秒用力呼气容量、25%最大呼气流量等指标,降低血清IgE,抑制IL-4、IL-13分泌,促进IFN-γ、IL-12产生,两者联合治疗对于降低IL-13、增加IFN-γ产生有协同作用。结论BCG-PNA和SIT能改善哮喘患儿肺功能,增强Th1反应,降低Th2应答,调节Th1/Th2平衡。两者联合治疗对改善哮喘患儿失衡的细胞因子网络有一定协同作用。

CD40L、可溶性黏附分子及MMP9在川崎病中的表达及意义

目的:研究T细胞CD40配体(CD40L)、血浆中可溶性E选择素(sE-selectin)、可溶性细胞间黏附分子1(sI-CAM-1)和基质金属蛋白酶9(MMP9)在川崎病中的表达及意义。方法:用流式细胞双色荧光标记技术检测20例川崎病急性期及静脉注射免疫球蛋白(IVIG)治疗后的患儿,19例正常对照,外周血T细胞表达CD40L阳性细胞率及平均荧光强度;用ELISA方法检测上述3组血浆中sE-selectin、sICAM-1和MMP9水平。结果:急性期川崎病组T细胞CD40L表达明显高于IVIG治疗后组(P<0.05),川崎病患儿T细胞CD40L表达较正常对照持久;2例伴冠状动脉损害(CAL)的川崎病患儿急性期T细胞CD40L表达高于无CAL者。急性期川崎病组血浆sICAM-1、MMP9明显高于IVIG治疗后组,急性期川崎病患儿血浆sE-se-lectin、sICAM-1明显高于正常对照(P<0.05)。川崎病急性期T细胞表达CD40L与血浆sE-selectin、sICAM-1、MMP9水平无明确相关性(P>0.05)。结论:T细胞表达CD40L升高在川崎病血管炎及冠状动脉病变中可能起一定作用。血浆sE-selectin、sI-CAM-1和MMP9水平可作为反映川崎病血管炎的指标。

一种改良型小鼠哮喘模型方法的建立及评价

目的:改良建立小鼠哮喘模型的方法并评价其效果.方法:清洁级BALB/c小鼠20只,随机分为模型组和对照组,模型组于第0和14d注射OVA(卵清蛋白)致敏,第21～25天雾化吸入5%OVA激发,对照组用生理盐水替代.结果:模型组在激发过程中出现明显头面部瘙痒,呼吸加深加快,安静少动,弓背,前肢缩抬等哮喘急性发作表现.BALF(支气管肺泡灌洗液)中白细胞总数及嗜酸性粒细胞分类明显增多.血清及BALF中IL-4明显增高,INF-γ下降,OVA特异性IgE增高.肺组织病理切片见小支气管及伴行血管周围有较多炎症细胞浸润,可见大量嗜酸性粒细胞,杯状细胞增生,平滑肌增厚,部分肺泡间隔融合形成肺气肿.结论:通过对小鼠哮喘模型建立方法的改良,成功复制出小鼠哮喘发作的动物模型.

不同饲养环境、种属、佐剂及激发方法对小鼠哮喘炎症的影响

目的研究不同饲养环境、种属、佐剂及激发方法对小鼠哮喘样炎症的影响。方法应用普通级或清洁级的BALB/c和C57BL小鼠,以鸡卵白蛋白作过敏原,采用氢氧化铝和明矾佐剂及滴鼻和雾化的激发方式制备小鼠哮喘模型,进行支气管肺泡灌洗液(BALF)炎症细胞分类记数和观察细支气管周围的嗜酸性粒细胞(Eos)炎症。结果BALB/c和C57BL小鼠嗜酸性粒细胞炎症无差异,清洁级比普通级、明矾佐剂比氢氧化铝佐剂、多次的雾化比一次滴鼻的激发方式能更明显地诱导小鼠哮喘炎症。结论小鼠哮喘炎症程度受饲养环境、种属、佐剂及激发方法的影响,实验设计时应予充分的注意。

卵清蛋白雾化吸入诱导肠道菌群失调小鼠肺部过敏反应的发生

目的:在抗生素所致肠道菌群失调小鼠模型上采用卵清蛋白(OVA)雾化吸入激发,探讨气道变应性反应与肠道菌群失调的关系。方法:112只BALB/c小鼠分为6组:菌群失调Ⅰ组、对照Ⅰ组、菌群失调Ⅱ组、菌群失调加激发组、激发组、对照Ⅱ组。前2组和后4组分别于第6天和第14天时取盲肠内容物做细菌培养计数,后4组同时行支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞分类计数、BALF和血清中OVA特异性IgE(OVA-sIgE)检测以及肺部病理观察;采用流式细胞术检测肺组织中Th1以及Th2细胞水平。结果:应用抗生素的小鼠出现肠道菌群失调,菌群失调加激发组小鼠肺部出现以嗜酸粒细胞和淋巴细胞为主的炎症细胞浸润,肺部黏液分泌明显增高,BALF中细胞总数、淋巴细胞、嗜酸粒细胞和中性粒细胞增加,OVA-sIgE水平显著增高,肺部Th2细胞水平增高,Th1细胞与对照组无差异。结论:抗生素致肠道菌群失调小鼠经过OVA雾化吸入后,可产生Th2细胞优势的变应性气道反应,提示抗生素所致肠道菌群失调是诱发哮喘等变应性疾病的危险因素之一。

RNA干扰技术与利巴韦林体外抗呼吸道合胞病毒的效应

目的比较RNA干扰(RNAi)技术与利巴韦林抗呼吸道合胞病毒(RSV)效应,探讨RNAi技术体外抑制RSV的有效性。方法用成功构建的表达载体pshRNA7816及利巴韦林处理HEp-2细胞,利用四甲基偶氮唑蓝比色实验检测pshRNA7816、利巴韦林的细胞毒性和对RSV感染后细胞的保护作用;通过显微镜观察pshRNA7816及利巴韦林对RSV感染细胞病变的抑制效率。结果pshRNA7816对HEp-2细胞的正常生长无明显细胞毒性作用,而利巴韦林在1.0mmol/L以上作用浓度即会对细胞产生细胞毒性作用;pshRNA7816和利巴韦林均能抑制RSV所致的细胞病变,但pshRNA7816对细胞病变抑制作用较利巴韦林强,经过pshRNA7816处理过的RSV感染细胞的细胞存活率明显高于利巴韦林对RSV的最大抑制率(P<0.05)。结论根据RNAi技术所设计的重组质粒pshRNA7816在体外细胞培养系统中较利巴韦林抗RSV活性强。

静脉注射丙种球蛋白对川崎病外周血单个核细胞CD40L表达的影响

目的 观察川崎病 (kawasakidisease,KD)急性期患儿外周血单个核细胞 (PBMC)表面CD4 0配体 (CD4 0L)表达水平 ,及静脉注射丙种球蛋白 (IVIG)治疗后CD4 0L的变化 ,以期探讨IVIG治疗机制及冠状动脉病变 (CAL)发生的可能机制。方法 用流式细胞技术法检测 11例川崎病急性期患儿及 1g/kgIVIG治疗后其PBMC表达CD4 0L阳性细胞率及平均荧光强度 (MFI)。结果 川崎病患者PBMC表面CD4 0L表达较正常对照持久 ;对 1g/kgIVIG敏感者治疗后患者PBMC上表达CD4 0L下降 ,与治疗前比较有显著性差异 ;对 1g/kgIVIG不敏感者治疗后PBMC中高表达CD4 0L的细胞数增多 ,与正常对照比较有显著性差异 ;2例急性期已发生冠状动脉扩张的患儿其PBMC上的CD4 0L表达的阳性细胞率及平均荧光强度均明显高于无冠状动脉病变者。结论 CD4 0L升高在川崎病发病及冠状动脉病变中起一定作用 ,IVIG可能通过下调川崎病PBMC上CD4

噻唑蓝(MTT)法空斑形成实验在病毒检测中的应用

目的:探讨噻唑蓝(MTT)法空斑形成实验在病毒滴度检测中的应用。方法:用噻唑蓝(MTT)代替常规的中性红作为染色剂进行空斑形成实验MDCK和Hep-2细胞在12孔板上形成单层后,分别感染流感病毒和呼吸道合胞病毒,加入单层琼脂糖代替传统双层琼脂糖培养3-4天,用噻唑蓝(MTT)代替常规的中性红作为染色剂计数空斑。结果:⑴MTT法空斑形成实验检测流感病毒和RSV病毒滴度操作简单,时间短;⑵与常规中性红法空斑形成实验比较检测病毒滴度没有差异;⑶MTT法可以避免假空斑形成。结论:MTT法空斑形成实验可替代中性红法空斑形成实验,且更快速、准确。

哮喘患者外周血DC参与Th2型偏移

体外诱导和扩增树突状细胞(DC)并从形态学、细胞超微结构、特异性表面标志、分泌的细胞因子和混合淋巴细胞反应等五方面予以鉴定并研究其在哮喘中的生物学功能。采用正常人外周血单个核细胞(PBMC)经贴壁去除悬浮细胞,加入细胞因子(IL-4、GM-CSF)培养7 d后,LPS刺激其成熟。通过形态学观察、特异性表面标志、分泌细胞因子IL-12的能力及混合淋巴细胞反应予以鉴定,ELISA法检测DC分泌的细胞因子IL-12以及与自身T细胞反应后,流式细胞术检测T细胞分泌的胞内细胞因子IL-4和IFN-γ水平。结果显示正常人外周血诱导的DC具有典型的树突状突起和超微结构,高表达特异性表面标志物CD1a和CD83,分泌细胞因子IL-12以及很强的促进T细胞增殖功能。DC诱导培养第8天,哮喘组DC分泌的IL-12水平低于正常对照组,差异有显著性意义(P<0.01);混合培养第7天,哮喘组IFN-γ水平低于正常对照组(P<0.05),而IL-4和IL-4/IFN-γ比值均高于正常对照组,有显著性差异(P<0.01)。因而PBMC经细胞因子的序贯培养,可获得高纯度、功能性的DC,且该DC能通过调节IL-12的分泌在哮喘发病机制中发挥重要作用,为DC在肿瘤免疫、感染免疫、抗移植排斥等方面的研究奠定了基础。

小鼠呼吸道合胞病毒感染肺TLR4表达与气道高反应性

目的:研究小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染对肺TLR4表达与气道高反应性的影响。方法:生后6周16只清洁级BALB/c小鼠被同等分成RSV感染组和对照组,感染后1周两组经吸入相同递增浓度乙酰甲胆碱检测气道高反应性,使用RT-PCR方法测定肺组织TLR4mRNA表达,并对二者的相关性进行了分析。结果:在吸入乙酰甲胆碱浓度为3.2g/L时两组气道阻力差异有显著性(P<0.01)。TLR4/β-actin的值分别为对照组0.239±0.055,RSV感染组0.361±0.102,两组间有显著性差异(P<0.05);TLR4 mRNA表达与吸入3.2g/L乙酰甲胆碱时的气道反应性呈正相关,相关系数为0.721(P<0.05)。结论:小鼠RSV感染后肺TLR4表达增强并呈气道高反应性,二者之间有显著正相关。

肠道菌群失调促进小鼠肺树突状细胞成熟并增强TLR2和TLR4表达

目的观察卵清蛋白(OVA)雾化吸入激发对抗生素所致肠道菌群失调小鼠肺组织中树突状细胞(DC)成熟度和Toll样受体2(TLR2)、TLR4表达的影响。方法将64只3周龄雌性BALB/c小鼠随机分为4组,菌群失调组、菌群失调加激发组、激发组、对照组,每组16只。于实验第14天用流式细胞术检测肺组织中DC成熟度(MHC-Ⅱ类分子)及其膜表面TLR2、TLR4的表达水平,采用免疫组织化学法检测肺组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、白细胞介素-6(IL-6)蛋白表达,ELISA检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中TGF-β1、IL-6的产生水平。结果与对照组和激发组比较,菌群失调组及菌群失调加激发组小鼠肺组织中DC细胞膜表面MHC-Ⅱ类分子及TLR2、TLR4的表达均增加,但这些分子在上述2组中的表达无差异(P>0.05)。与其他3组比较,菌群失调加激发组小鼠肺组织及BALF中TGF-β1、IL-6水平增高。结论肠道菌群失调使肺部DC成熟度增高,TLR2、TLR4表达增强。

靶向呼吸道合胞病毒M2基因pshRNA载体质粒的构建及意义

目的:构建针对呼吸道合胞病毒(RSV)M2基因m RNA的短发卡结构状RNA(shRNA)重组载体质粒,为利用RNA干扰技术抗RSV感染的深入研究奠定基础;方法:按shRNA设计原则,选择RSV-M 2基因作为靶基因,设计19bp长的能产生短发卡结构的两段DNA反向重复序列,中间以9bp序列间隔,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pgenesil-1上,重组质粒经酶切和测序鉴定,然后将构建成功的重组质粒转染H EP2细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光细胞发生率以评估转染效率。结果:将设计合成的DNA片段成功克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的序列,并且荧光显微镜下观察细胞有较多的绿色荧光蛋白表达。结论:成功构建了针对RSV M 2基因m RNA的shRNA重组载体质粒,可利用重组质粒进一步研究其对RSV感染的抑制,从而为抑制RSV感染寻找新的基因治疗手段。

树鼠句呼吸道合胞病毒感染动物模型的建立

探讨用灵长类动物树鼩建立呼吸道合胞病毒（RSV）感染动物模型的可行性。28只树鼩随机分为7组，每组4只，鼻内滴入10^6PFU RSV，感染后每24h检测1组：另取7只树购鼻内滴入100μl Hep-2细胞培养液，滴鼻后每24h检测1只作对照：无菌取树鼩肺组织进行病毒分离、空斑形成实验检测病毒滴度、病理检查和RT-PCR检测肺组织内RSV mRNA表达：结果显示：树鼩感染RSV后，无明显呼吸道感染症状；树鼩肺组织匀浆接种于Hep-2细胞上，第3、4、5实验组出现细胞病变效应（CPE）；树鼩感染RSV后肺部病理改变在3～7d较为明显，主要为间质改变；在10^6 PFU感染浓度下树鼩肺组织内RSV处于低水平复制，复制的高峰期在3～5d，峰值在第4d。提示：树鼩可以用来建立RSV感染的动物模型。

短发卡结构状RNA体外抑制呼吸道合胞病毒M2基因mRNA水平和病毒蛋白表达的研究

目的观察针对人类呼吸道合胞病毒(RSV)M2基因mRNA构建的短发卡结构状RNA重组质粒在细胞水平对RSV复制的影响,为利用RNA干扰技术抑制RSV感染的研究奠定基础。方法将已成功构建的重组质粒pshRNA7816/8330转染HEp-2细胞,通过显微镜观察pshRNA7816/8330对RSV感染细胞病变(CPE)的抑制效率,利用四甲基偶氮唑盐比色实验检测pshRNA7816/8330的细胞毒性,经RT-PCR方法检测pshRNA7816对RSVM2mRNA表达的影响,免疫细胞化学染色法检测pshRNA7816对细胞内RSV蛋白的影响。结果pshRNA7816/8330对HEp-2细胞的正常生长没有明显的细胞毒性作用,2个重组质粒均能抑制RSV所致的CPE,但pshRNA7816对CPE抑制作用较pshRNA8330要强,RT-PCR和免疫细胞化学染色法结果显示pshRNA7816能明显降低RSVM2基因mRNA和RSV蛋白表达水平。结论针对RSVM2-1基因所构建的短发卡结构状RNA重组质粒pshRNA7816在细胞水平能有效抑制RSV的CPE形成降低RSVM2mRNA和病毒蛋白表达水平,从而干扰RSV的复制。