SK-N-SH神经母细胞瘤干细胞培养及鉴定

背景:神经母细胞瘤是儿童较为常见的实体瘤,儿童肿瘤受环境因素影响小,其与发育的关系紧密。而悬浮法是一种有效并可靠的获得肿瘤干细胞的方法。目的:采用悬浮法培养人神经母细胞瘤SK-N-SH,获得具有干细胞特性的克隆球,并对其生物学特性进行鉴定。方法:采用无血清悬浮培养的方法,获得具有克隆性增生的肿瘤球,免疫荧光鉴定克隆球细胞是否具有干细胞特性;通过荧光素酶标记SK-N-SH神经母细胞瘤,将所得克隆球与普通培养肿瘤细胞种植在裸鼠背部,活体成像监测细胞在裸鼠体内的增殖特性。结果与结论:悬浮培养法可将SK-N-SH神经母细胞瘤培养成克隆球,将无血清培养的克隆球免疫荧光检测分子生物学标记,显示强阳性表达,将其种植于裸鼠背部皮下显示其具有较强增殖与转移的生物学特性。提示悬浮法培养的SK-N-SH神经母细胞瘤克隆球,分子生物学标记巢蛋白Nestin强表达,胶质原纤维酸性蛋白、特异性神经元管蛋白(Tuj-1)弱表达,具有神经干细胞的特性,在裸鼠体内具有较强的增殖性与转移侵袭性。

Dkk1对骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探讨经典Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的影响。方法:以C3H10T1/2为目的细胞,通过重组腺病毒介导BMP9过表达,联用重组腺病毒Dkk1抑制经典Wnt信号通路。检测各处理组碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性变化、钙盐沉积、骨钙素(osteocalcin,OC)、骨桥素(osteopontin,OPN)变化;体内异位成骨实验分析Dkk1对BMP9诱导MSCs成骨分化的影响。结果:BMP9可诱导C3H10T1/2细胞成骨分化;Dkk1显著降低BMP9诱导的C3H10T1/2细胞ALP活性(F=1 467.21,P=0.000)、钙盐沉积、OC(F=32.95,P=0.000)和OPN(F=127.23,P=0.000)蛋白表达;异位成骨模型中Dkk1抑制BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化和骨块成熟。结论:Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1可降低BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化可能需要经典的Wnt信号通路参与。

AP2α重组腺病毒质粒的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建转录因子AP2α(Activator protein 2α)重组腺病毒质粒,感染大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymalstem cells,MSCs),并检测其表达。方法从大鼠PC12细胞总RNA中PCR扩增AP2α基因,定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAdtrace-TOX,构建重组质粒,与腺病毒骨架质粒pAd-Easy1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-AP2α,转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒Ad-AP2α,感染大鼠骨髓MSCs,荧光显微镜下观察RFP的表达;Real-time PCR及Western blot检测AP2α的表达。结果 pAdtrace-AP2α质粒经PCR及双酶切鉴定,均可见约1 400 bp的目的基因条带,测序结果与GenBank报道一致,并正确克隆至腺病毒质粒中;重组腺病毒pAd-AP2α在HEK293细胞中包装,病毒滴度可达2.6×108pfu/ml;感染MSCs 48 h可观察到60%以上的RFP阳性细胞,经Real-time PCR及Western blot鉴定,感染后72 h,MSCs中AP2α的表达显著增高(P<0.01)。结论成功构建了携带转录因子AP2α的重组腺病毒质粒,其能有效感染MSCs,增强MSCs中AP2α的表达。

视黄酸核受体α的siRNA重组腺病毒构建及干扰效果初步鉴定

目的：构建视黄酸核受体a（RARa）的siRNA重组腺病毒，为反向研究RARa受体在全反式视黄酸（ATRA）抗凋亡过程中的作用提供实用的技术手段。方法：设计3对大鼠RA风的siRNA序列，将其分别克隆到pSES-HUS穿梭质粒；进而将重组穿梭质粒pSES-HUS-siRARa与pAdEasml在BJ5183感受态大肠埃希菌内同源重组以得到pAd-siRARa，PacI酶切线性化后转染HEK293进行包装扩增以得到重组腺病毒Ad-siRAR^Ad-siRARa感染大鼠PCI2细胞48h，提取各组mRNA和总蛋白，Real-timePCR和免疫印迹检测Ad-siRAR^-I、一2、一3对RARQ的抑制效率。结果：PCR、酶切及测序均证实RARa的siRNA序列正确克隆至腺病毒质粒载体，经过包装扩增得到大量高滴度重组腺病毒Ad-siRARa，而且对RARa的表达抑制效率接近70％。结论：成功构建视黄酸核受体RARⅡ的siRNA重组腺病毒，并具有下调PCI2细胞RARa基因和蛋白表达的功能。

骨不连微环境中骨形态发生蛋白-9与表皮生长因子受体表达变化的初步研究

目的:研究骨不连微环境下局部组织中骨形态发生蛋白-9(bone morphogenetic protein-9,BMP9)与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达及成骨细胞与破骨细胞数量的变化,为骨不连的病因与治疗提供依据。方法:选取12只健康的3月龄新西兰大白兔为实验组构建骨不连动物模型,同时选取6只同龄同种健康兔为对照组,以X射线检查验证造模是否成功,以Western blot、免疫组织化学检测局部组织中BMP9与EGFR表达量的变化,以苏木素-伊红(hematoxylineosin,HE)染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartaric acid resistance,TRAP)染色观察局部组织中成骨细胞与破骨细胞数量。结果:X射线检查结果提示骨不连动物模型构建成功,Western blot和免疫组织化学结果提示骨折愈合后期BMP9与EGFR表达量较骨折愈合早期明显降低,且骨不连微环境中BMP9表达量较对照组明显降低,但EGFR表达量较对照组差异不明显;HE染色和TRAP染色结果提示骨折愈合后期成骨细胞数量较骨折愈合早期明显减少,且骨不连微环境中成骨细胞数量较对照组减少更明显,但实验组与对照组破骨细胞数量在骨折早期、后期均无明显差异。结论:骨不连可能与局部组织中BMP9、EGFR表达量降低及成骨细胞的数量减少有关。

视黄酸核受体γ重组腺病毒构建及其鉴定

目的构建携带大鼠视黄酸核受体γ（retinoic acid receptor γ，RARγ）的重组腺病毒，为研究RAR3,在骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）成神经分化中的作用奠定基础。方法体外扩增大鼠础研基因，将其定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAd Trace—TOX构建重组质粒pAdTrace—RARγ，并在BJ5183菌中与骨架质粒pAd Easy-1重组获得腺病毒载体pad—RARγ，Pac I酶切后转染HEK293细胞包装腺病毒。腺病毒Ad—RARγ感染大鼠MSCs，Real—time PCR和Western印迹检测RARγ的表达。结果PCR，酶切及测序均证实础研正确克隆至腺病毒质粒载体中，Ad—RARγ对MSCs感染率达60％～70％，并明显增强础研基因和蛋白的表达。结论成功构建携带RARγ的重组腺病毒，并具有上调大鼠MSCsRA脚基因和蛋白表达的功能。