儿童腹部闭合性损伤131例的诊治分析

目的探讨儿童腹部闭合性损伤的诊断与治疗。方法儿童腹部闭合性损伤131例进行回顾性分析研究。结果闭合性损伤单纯腹内脏器损伤90例,伴发腹外脏器损伤41例。非手术处理109例,手术处理22例。131例患儿均痊愈出院,住院期间无并发症及死亡发生。结论对于儿童腹部闭合性损伤的诊治中要警惕有无伴发内脏及腹外脏器损伤,对损伤的脏器及性质应及时准确判断,以便及时采取相应的诊疗措施。非手术保守治疗为主要治疗方案。

LETM1对骨肉瘤细胞恶性生物学行为的作用及其机制

目的 探讨亮氨酸拉链-EF-hand跨膜蛋白1(LETM1)对人骨肉瘤MG63及143B细胞增殖、迁移、凋亡、成骨分化及体内成瘤的作用及其机制。方法 将骨肉瘤MG63及143B细胞分为空白对照组(未加入腺病毒感染)、阴性对照组(sh-NC组,用RNAi阴性对照病毒感染)及LETM1敲低组(sh-LETM1组,用sh-LETM1腺病毒感染)。采用Western blotting检测各组LETM1蛋白在健康人成骨细胞hFOB1.19及骨肉瘤细胞中的表达水平,以验证腺病毒敲低效果;细胞克隆形成实验及CCK-8法检测细胞增殖情况;划痕愈合实验及Transwell实验检测细胞迁移情况;DAPI染色法及Annexin V-APC/7-AAD流式细胞术双染法检测细胞凋亡情况;碱性磷酸酶(ALP)染色及茜素红S染色检测细胞的早期及晚期成骨分化情况。将10只裸鼠分为sh-NC组(n=5,以RNAi阴性对照病毒感染的143B细胞注入裸鼠皮下)与sh-LETM1组(n=5,以sh-LETM1腺病毒感染的143B细胞注入裸鼠皮下),并采用裸鼠皮下成瘤实验检测各组细胞的体内成瘤能力。结果 Western blotting检测结果显示,LETM1蛋白在骨肉瘤MG63及143B细胞中的表达明显高于健康人成骨细胞hFOB1.19(P<0.05),sh-LETM1腺病毒感染MG63及143B细胞后明显降低了LETM1蛋白的表达。细胞克隆形成实验及CCK-8法检测结果显示,在MG63及143B骨肉瘤细胞中,sh-LETM1组较sh-NC组及空白对照组的克隆形成能力及增殖能力明显降低(P<0.01)。Wound-healing实验及Transwell实验结果显示,在MG63及143B骨肉瘤细胞中,sh-LETM1组较sh-NC组及空白对照组的细胞迁移率明显降低(P<0.01)。DAPI染色及流式细胞术结果显示,在MG63及143B骨肉瘤细胞中,sh-LETM1组较sh-NC组的细胞凋亡率明显增高(P<0.01)。ALP染色及茜素红S染色实验结果显示,在MG63及143B骨肉瘤细胞中,sh-LETM1组较sh-NC组及空白对照组染色区域及钙盐结节增多。裸鼠皮下成瘤实验结果显示,143B sh-LETM1组较143B sh-NC组细胞的皮下成瘤能力降低。结论 LETM1可促进MG63和143B骨肉瘤细胞的增殖、迁移及体内成瘤,其机制可能与抑制细胞凋亡及成骨分化有关。

注射治疗婴幼儿特殊部位血管瘤

目的研究局部注射疗法治疗婴幼儿颌面部及会阴部血管瘤的疗效及并发症，总结婴幼儿特殊部位血管瘤的治疗经验。方法采用醋酸曲安奈德注射液加平阳霉素，局部注射治疗婴幼儿颌面部及会阴部草莓状、海绵状、混合性血管瘤。一次未愈，间隔4～6周重复给药，同时指导家属护理，治疗或预防溃烂，4次为一个疗程，醋酸曲安奈德总量不超过100mg，平阳霉素总量不超过40mg；观察血管瘤消退情况。结果107例患儿，经1年随访，治愈率（87．8％），显效率（9．3％），无效率（2．8％）。结论该方法安全可靠、疗效显著、并发症少、外观较满意，适合婴幼儿特殊部位血管瘤的治疗。

经后矢状入路肛门直肠成形术治疗中高位肛门直肠畸形疗效分析

目的 回顾性分析44例经后矢状入路肛门直肠成形术（posterior sagittal anorectoplasty，PSARP）治疗不同年龄、中高位肛门直肠畸形病例，讨论新生儿一期行PSARP的可能性。方法 回顾分析了1993年2月至2005年1月在我院采用PSARP治疗的中高位肛门直肠畸形44例，初步随访并总结术后疗效及排便功能。结果 15例在新生儿期行结肠造瘘术，术后3～7个月行PSARP；其余29例（9例新生儿、2个月至9岁20例）均一期行PsARP，2例新生儿术后死亡。21例患儿术后随访6个月至5年，18例排便情况经临床评分结果为优良。结论 PSARP治疗中高位肛门直肠畸形，疗效满意。新生儿在条件许可下,一期行PSARP,仍可获良好的排便功能。

MDR1基因修饰的自体骨髓移植后体内表达及时限的研究

目的研究多药耐药基因1(multidrug resistanle gene 1,MDR1)转染的骨髓单个核细胞自体移植后,外源性MDR1基因在骨髓中的功能性表达及时限。方法体外浓缩病毒上清转染法将MDR1基因导入兔骨髓单个核细胞;经大剂量环磷酰胺化疗预处理后,将转染的骨髓单个核细胞行自体骨髓移植;采用PCR法、免疫组织化学法和柔红霉素(daunorubicin,DNR)排出试验检测MDR1基因在受体骨髓中的整合及功能性表达。结果自体骨髓移植后1～4个月,PCR法检测到外源性MDR1基因在骨髓细胞基因组中的整合;免疫组化法测得骨髓单个核细胞中P-gp阳性率分别为9·5%、8·5%、6·0%、3·5%;柔红霉素排除试验检测到定植的MDR1基因能功能性的表达。结论转染MDR1基因的骨髓单个核细胞自体移植后,MDR1基因能定植于骨髓中并功能性的表达4个月。

超声辐照维拉帕米微泡体外对神经母细胞瘤多药耐药的逆转作用

目的探讨超声辐照维拉帕米(verpamil,VER)微泡逆转肿瘤多药耐药的作用及机制。方法制备包裹维拉帕米的乳酸-羟基乙酸共聚物(VER-PLGA)超声微泡造影剂;通过长春新碱(VCR)多次小剂量递增诱导法建立神经母细胞瘤耐药株(SK-N-SH/VCR),并检测其耐药性;根据处理因素不同分为6组:A:空白对照组(SK-N-SH/VCR培养组),B:SK-N-SH/VCR+VER(50μg/ml)组,C:SK-N-SH/VCR+VER(250μg/ml)组,D:SK-N-SH/VCR+超声辐照组,E:SK-N-SH/VCR+PLGA微泡+超声辐照组,F:SK-N-SH/VCR+VER-PLGA微泡(VER50μg/ml)+超声辐照组。48h后,利用RT-PCR和免疫组织化学染色法(ICC)检测各组细胞中MDR1基因及P-gp的表达水平,评估VER在不同处理组中逆转肿瘤细胞耐药的效果。结果①成功制备包裹维拉帕米的VER-PLGA微泡造影剂,包封率为32%;②成功建立神经母细胞瘤耐药株SK-N-SH/VCR,MTT法证实其对不同化疗药物的耐药倍数是野生株的2.3～5.4倍;③ICC证实耐药株高表达MDR1基因;④RT-PCR及免疫组化法检测发现MDR1基因在F组中的光密度值及P-gp表达水平较其他组明显降低(P<0.05)。结论超声辐照包裹小剂量维拉帕米的微泡可有效逆转肿瘤多药耐药。

多药耐药基因转染骨髓单个核细胞移植联合化疗治疗乳腺癌的实验研究

目的研究外源性人多药耐药基因(human multidrug resistance gene 1,hMDR1)转染骨髓单个核细胞(mono-nuclear cells,MNCs)移植联合超剂量表阿霉素化疗在4T1乳腺癌治疗中的骨髓保护和治疗作用。方法用携带目的基因hMDR1和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)报告基因的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-hMDR1-GFP)转染原代培养的MNCs以获取hMDR1基因修饰的MNCs(MNCs-rAd-hMDR1-GFP),将修饰后的MNCs移植到4T1乳腺癌模型体内,在表阿霉素超剂量化疗中观察骨髓造血功能的保护和肿瘤的治疗效果。结果 hMDR1基因成功转入小鼠骨髓单个核细胞,体外转染率达26.26%;转染细胞移植后能定植于受体骨髓中并功能性表达。在超剂量化疗中,hMDR1基因能有效保护受体骨髓的造血功能,荷瘤动物能耐受3倍剂量表阿霉素化疗,外周血白细胞数能维持在(5.7±0.6)×109/L;同时超剂量化疗能迅速杀灭肿瘤细胞,使荷瘤动物存活时间明显延长(P<0.05),治愈率明显提高(P<0.05)。结论 hMDR1基因转染骨髓造血细胞移植能明显提高受体骨髓对化疗药物的耐受性,联合超剂量化疗能快速、有效的杀灭肿瘤细胞,提高恶性肿瘤的治愈率。

提高mdr1基因体外转染骨髓造血细胞效率的实验研究

目的:探讨mdr1基因体外转染兔骨髓造血细胞的条件及转染后在细胞中的功能性表达。方法:秋水仙碱(90ng/ml)筛选含人mdr1cDNA的产病毒包装细胞PA317-HaMDR1/A,制备浓缩病毒上清液并转染兔骨髓单个核细胞;分别用PCR法、免疫组织化学法和柔红霉素(daunorubicin DNR)排出试验检测mdr1基因的整合及功能性表达。结果:经秋水仙碱筛选后,产病毒包装糖蛋白(P-glycoprotein P-gp)表达增强;外源性mdr1基因能成功的导入兔骨髓造血细胞,转染2日、4日的转染率分别为22%、37%;转入的mdr1基因能发挥药物外排泵的功能。结论:采用浓缩病毒上清转染法能成功的将外源性mdr1基因导入兔骨髓造血细胞中并获得稳定的功能性表达,为进一步研究mdr1基因转染骨髓造血细胞后自体回输在大剂量化疗中对骨髓保护作用的研究提供了依据。

敲低3-磷酸甘油酸脱氢酶靶向能量代谢逆转骨肉瘤恶性生物学的行为

目的探讨敲低3-磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)靶向能量代谢对人骨肉瘤143B细胞恶性生物学行为及成骨分化的影响。方法Real-time PCR及Western blotting检测PHGDH在成骨细胞hFOB1.19和不同恶性程度骨肉瘤细胞TE85、MG63、143B中的表达。采用脂质体转染法将短发夹RNA(shRNA)-PHGDH重组质粒转染至143B细胞中,Real-time PCR和Western blotting检测PHGDH的表达变化;结晶紫染色法、细胞计数法、CCK-8实验检测细胞增殖;划痕实验检测细胞平行迁移能力,Transwell实验检测细胞垂直迁移及侵袭能力;Annexin V-FITC/PI双染法、DAPI染色法检测细胞凋亡;碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红S染色检测成骨分化作用,Western blotting检测成骨分化指标Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OC)的表达情况;Real-time PCR检测能量代谢相关基因葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、6-磷酸果糖激酶1(PFK1)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)、乳酸脱氢酶A(LDHA)的表达,乳酸检测试剂盒测定乳酸分泌量,三磷酸腺苷(ATP)检测试剂盒检测ATP产生量。结果PHGDH在143B细胞中的表达明显高于在hFOB1.19、MG63和TE85细胞中(P<0.01);转染shRNA-PHGDH重组质粒使143B细胞中的PHGDH表达量降低(P<0.01)、增殖能力降低(P<0.01)、细胞迁移及侵袭能力减低(P<0.01)、凋亡率增高(P<0.01)、ALP染色阳性率增加(P<0.01)、茜素红染色阳性率增加(P<0.05)、Runx2(P<0.05)和OC的表达增高(P<0.01)、能量代谢相关基因(GLUT1、PFK1、PKM2、LDHA)的表达下调(P<0.01)、乳酸减少(P<0.01)、ATP增多(P<0.05)。结论敲低PHGDH可通过能量代谢抑制人骨肉瘤143B细胞增殖、迁移、侵袭,促进其凋亡,并促进其成骨分化。

Wnt5b过表达对小鼠胚胎肝干细胞分化的影响及其对小鼠慢性肝损伤的修复作用

目的探讨重组腺病毒介导的无翅型MMTV整合位点家族成员5b(Wnt5b)基因过表达对小鼠胚胎肝干细胞分化的影响及对小鼠慢性肝损伤的修复作用。方法将表达Wnt5b和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒,分别感染小鼠胚胎肝干细胞HP14-19,诱导其分化,采用Real-time PCR、Western blotting验证Wnt5b的表达,吲哚菁绿(ICG)摄取实验、高碘酸-希夫(PAS)染色检测HP14-19成肝分化能力,Real-time PCR检测肝细胞标志物白蛋白(Alb)和细胞角蛋白18(CK18)的表达;以48只雄性BALB/c小鼠为实验对象,随机分为对照组、模型组、干细胞治疗组及Wnt5b修饰的干细胞治疗组,采用CCl_(4)建立慢性肝损伤模型,干细胞治疗2周后取材,进行肝脏病理染色及免疫组织化学评估肝脏修复情况。结果Real-time PCR及Western blotting检测均显示,Wnt5b在HP14-19中成功过表达(P<0.001);Real-time PCR检测Wnt5b组细胞Alb、CK18的mRNA表达较GFP组及对照组均升高(P<0.001);ICG摄取实验、PAS染色提示,诱导7 d后Wnt5b组细胞ICG摄取能力及糖原合成能力均较GFP组显著增强(P<0.01);肝脏HE染色表明,模型组肝损伤明显,肝脏组织结构紊乱,干细胞组肝脏组织结构部分恢复,Wnt5b组肝组织恢复优于干细胞组;Masson染色显示,模型组有明显的纤维增生,Wnt5b组蓝染纤维较干细胞组更少(P<0.05);免疫组织化学显示Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、髓过氧化物酶(MPO)的表达在模型组明显升高,上述指标在Wnt5b组的表达水平较胎肝干细胞治疗组显著(P<0.05)。结论Wnt5b可诱导小鼠胎肝干细胞向成熟肝细胞样细胞分化,且此基因修饰的胎肝干细胞对慢性肝损伤小鼠肝脏的修复作用较胚胎肝干细胞更有优势。

超声微泡造影剂促腺病毒转染mdr1基因的体外实验

目的研究体外超声微泡造影剂促腺病毒转染mdr1基因的效率。方法扩增表达mdr1基因的重组腺病毒Ad5-mdr1并与微泡造影剂混合；密度梯度离心法分选兔骨髓单个核细胞，与腺病毒微泡造影剂混合，经超声辐照后常规培养；荧光显微镜下观察细胞内荧光强度表达；RT-PCR法检测骨髓单个核细胞基因组中外源性mdr1基因的表达；免疫组织化学法检测转染细胞中mdr1基因的表达产物。结果①转染后b（腺病毒转染组）、c（腺病毒转染＋超声辐照组）、d（腺病毒微泡造影剂转染组）及e（腺病毒微泡造影剂转染＋超声辐照组）组细胞内均有绿色荧光显示，a（常规培养组）组细胞内未见绿色荧光，e组细胞内荧光强度明显高于各对照组；②RTPCR法显示，除a组外其余4组在157bp处分别观察到特异性mdrl电泳条带，证实外源性mdr1基因通过腺病毒作为载体整合到细胞基因组中；③免疫组织化学法检测e组细胞P-gp表达阳性率（24％）显著高于a、b、Cxd（阳性率分别为0．5％、8．5％、10%、11．5％）各组（P〈0．05）。结论体外实验证实，超声微泡造影剂能促进以腺病毒为载体的mdr1基因转染和表达。