siRNA干扰wnt5a表达对Jurkat细胞生长的影响及机制研究

目的:干扰wnt5a在Jurkat细胞中的表达,探讨wnt5a对Jurkat细胞增殖、细胞周期、凋亡的作用及其机制。方法:采用大肠杆菌BJ5183内同源重组的方法构建特异性干扰wnt5a的腺病毒Ad5-wnt5asi,感染Jurkat细胞。实验分为实验组(感染重组腺病毒的Jurkat细胞)、空载体组(感染腺病毒的Jurkat细胞)及空白对照组(Jurkat细胞)。采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,RT-PCR检测各组细胞wnt5a、β-catenin、钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(Calmodulin dependent proteinkinaseⅡ,CaMKⅡ)、cyclinD1、c-myc、survivin mRNA表达,Western blot检测干扰前后β-catenin、CaMKⅡ、cyclinD1蛋白表达。结果:(1)实验组细胞增殖与空载体组及空白对照组相比显著增高(P<0.05)。(2)实验组与其他两组相比,G1期细胞比例显著降低,S期细胞比例显著增多(P<0.05),G2期细胞比例无明显差异(P>0.05)。实验组与其他两组相比,细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。(3)实验组细胞wnt5a mRNA表达降低(55.52±0.61)%,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)实验组与其他两组相比,CaMKⅡmRNA表达明显降低,β-catenin、cyclinD1、c-myc、survivin表达增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)CaMKⅡ、β-catenin、cyclinD1蛋白与mRNA表达变化一致。结论:靶向沉默wnt5a基因促进Jurkat细胞恶性增殖,抑制凋亡。作用机制可能为:下调wnt5a后,解除了非经典wnt信号通路对β-catenin的抑制,从而下游cyclinD1、c-myc、survivin靶基因上调,改变细胞周期并抑制凋亡,导致Jurkat细胞进一步增殖。

丹参酮ⅡA对川崎病急性期外周血单个核细胞核转录因子-κB活化及炎性细胞因子表达影响研究

目的探讨不同浓度丹参酮ⅡA(TanⅡA)对急性期川崎病(KD)患儿外周血单个核细胞(PBMC)核转录因子-κB(NF-κB)活化及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)表达的影响。同时探讨KD发病机制和了解TanⅡA抗炎作用效果。方法研究对象为2010年12月至2011年5月成都市妇女儿童中心医院住院的KD患儿20例(KD组),同期门诊健康体检儿童20例为健康对照组,采用Ficoll密度梯度离心法分离静脉血PBMC,并分组进行培养,即自然培养组(空白)、12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)、PMA+不同浓度TanⅡA(TanⅡA终浓度分别为1、3、10mg/L),采用免疫细胞化学法观察培养后各组细胞中NF-κB的活化率,通过双抗体酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组培养上清液中TNF-α、IL-8的表达量。结果 KD组不同培养条件各指标均高于健康对照组(P<0.05)。加入PMA培养后,KD组和健康对照组各指标均明显高于空白条件,差异有统计学意义(P均<0.05)。加入PMA+3mg/LTanⅡA培养后,健康对照组TNF-α的表达量无明显下降(P>0.05);NF-κB的活化率与TNF-α和IL-8的表达量呈正直线相关关系(r=0.817,P<0.01;r=0.782,P<0.01)。TNF-α与IL-8的表达改变相一致,亦呈正直线相关关系(r=0.709,P<0.01)。结论急性期KD患儿PBMCs中NF-κB活化增强及TNF-α、IL-8表达量增加,参与了急性期KD免疫炎性反应,可能介导了急性期KD免疫血管损伤;TanⅡA在急性期KD患儿PBMCs中的抗炎作用具有剂量依赖性,其抗炎作用机制可能是通过抑制NF-κB的活化,进而抑制其下游TNF-α、IL-8的表达而实现。