Notch信号在神经肽P物质对高氧暴露肺泡Ⅱ型上皮细胞的保护作用机制

目的探讨Notch信号在神经肽P物质(substance P,SP)对高氧状态下早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的作用机制。方法将原代分离培养的大鼠孕19d胎鼠AECⅡ随机分为4组:空气组和高氧组分别暴露在210mL/L和950mL/L氧气中;高氧+SP组于暴露前加SP;高氧+SP+L703.606组在高氧+SP组基础上加入SP受体拮抗剂L703.606。各组均培养24h后,流式细胞仪检测细胞凋亡率;微孔板检测系统和激光共聚焦显微镜检测超氧化物阴离子水平;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定细胞增殖能力;QPCR检测Notch1、Notch3基因的表达;Western blot检测Notch1、Notch3蛋白的表达。结果与空气组比较,高氧组细胞凋亡率及超氧化物阴离子的含量均显著增高,增殖率显著下降(P<0.01);高氧+SP组可显著降低细胞凋亡率及超氧化物阴离子的表达,提高细胞增殖率(P<0.01)。高氧组Notch1基因和蛋白的表达均明显降低(P<0.01),Notch3基因和蛋白水平表达均明显升高(P<0.01),高氧+SP组与单纯高氧组比较,Notch1基因和蛋白水平表达升高,Notch3基因和蛋白水平表达降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。高氧+SP+L703.606组与高氧组各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 SP可通过调控Notch信号通路的表达,抑制高氧诱发的AECⅡ细胞凋亡,减轻氧化损伤,促进细胞增殖的作用。

ε-聚赖氨酸对机械通气患儿下呼吸道和呼吸机管路定植细菌的干预作用

目的探讨ε-聚赖氨酸(ε-polylysine,ε-PL)对定植细菌的抑制作用,为呼吸机相关性肺炎(VAP)的预防、下呼吸道和呼吸机管路定植细菌的干预提供依据。方法以90例儿科重症监护病房(PICU)接受机械通气(MV)治疗的患儿为研究对象,监测其呼吸机管路更换前或脱机前的下呼吸道分泌物和呼吸机管路各部位的细菌定植,以定植细菌为指示菌进行ε-PL体外抑菌实验,确定最低抑菌浓度(MIC)。结果阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和白色假丝酵母菌为下呼吸道的主要定植菌群(43.3%),阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌为呼吸机管路的最主要定植菌群(56.5%)。ε-PL对细菌的MIC达到28μg/mL时对PICU接受MV治疗的患儿下呼吸道和呼吸机管路常见致病菌有很好的抑制效果。结论目前,阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌在PICU接受MV治疗患儿下呼吸道和呼吸机管路的定植致病菌中呈主导趋势;ε-PL能有效抑制下呼吸道和呼吸机管路的细菌生长,对临床干预细菌定植和预防VAP有重要指导意义。

高氧肺损伤幼鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞蛋白质组学变化的相关研究

目的通过蛋白质组学研究探讨高氧暴露后幼鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)的损伤机制。方法将早产SD大鼠原代AECⅡ细胞分为常氧组和高氧组,分别置于常氧(21%O2)和高氧(95%O2)中培养24h,于倒置相差显微镜下观察细胞形态学改变,用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测凋亡相关蛋白Bcl-2、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)表达水平,以保证高氧模型的成功建立;收集AECⅡ细胞总蛋白,采用串联质谱标签(TMT)标记定量蛋白质组技术检测其蛋白谱,以高氧暴露后差异倍数(FC)>1.5、P<0.05双标准筛选差异蛋白,并对其进行生物信息学分析;依据分析结果,将AECⅡ细胞分为常氧组、高氧组及高氧+MW167组〔细胞置于含95%O2的氧舱前30min加入10μmol/L的γ泌肽酶抑制剂MW167〕,培养24h后,用CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞活性,用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测Notch通路下游蛋白毛状蛋白(Hes1)和促凋亡蛋白Bax的mRNA表达。结果①光镜下观察,常氧组细胞明显增殖、延展,胞质颗粒物质丰富;高氧组细胞核固缩,胞质内颗粒物质明显减少。与常氧组相比,高氧组细胞caspase-3蛋白表达明显增高,Bcl-2蛋白表达明显降低(caspase-3/GAPDH:1.352±0.086比0.769±0.080,Bcl-2/GAPDH:0.614±0.060比1.361±0.078,均P<0.01)。②蛋白质组学鉴定出差异蛋白162个,其中高氧暴露后上调的差异蛋白主要参与各种刺激的应答,定位于胞外区;高氧暴露后下调的差异蛋白主要与物质合成相关,定位于细胞基质区域。对差异蛋白通路富集分析(KEGGPathway分析)结果表明,细胞色素P450代谢、线粒体氧化磷酸化、Notch信号通路等可能与高氧损伤AECⅡ细胞机制相关。③与常氧组比较,高氧组AECⅡ细胞活性显著下降,Hes1、BaxmRNA表达水平明显升高〔细胞活性(A值):0.060±0.003比1.058±0.017,Hes1mRNA(2^-ΔΔCt):2.235±0.606比1.144±0.107,BaxmRNA(2^-ΔΔCt):2.210±0.240比1.084±0.096,均P<0.05〕。与高氧组比较,高氧+MW167组细胞活性明显升高,Hes1、BaxmRNA表达水平明显下降〔细胞活性(A值):0.271±0.025比0.060±0.003,Hes1mRNA(2^-ΔΔCt):0.489±0.046比2.235±0.606,BaxmRNA(2^-ΔΔCt):1.289±0.041比2.210±0.240,均P<0.05〕。结论高氧肺损伤幼鼠AECⅡ细胞损伤机制可能与细胞色素P450代谢、线粒体氧化磷酸化等途径的改变以及Notch信号通路的激活有关。

神经肽P物质对高氧损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化/抗氧化状态的影响

目的探讨神经肽P物质(Substance P,SP)对高氧损伤早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial celltypeⅡ,AECⅡ)氧化/抗氧化状态的影响。方法将分离培养的原代早产大鼠AECⅡ随机分为4组:空气组(将细胞置5%CO2、21%O2的孵箱中)、高氧组(将细胞置5%CO2、95%O2的密闭氧仓中)、高氧SP组(细胞培养液中预先加入5×10-8mol/L的SP,再置高氧中)和高氧SP受体拮抗剂组(细胞培养液中预先加入5×10-8mol/L的SP和5×10-7mol/L的L703.606,再置高氧中),各组细胞培养24 h后,镜下观察细胞形态的变化;MTT法检测细胞的增殖活力;流式细胞术检测细胞周期;JC-1探针法检测细胞凋亡早期线粒体膜电位的变化;化学比色法检测细胞丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、总抗氧化能力(Total antioxidative capacity,TAOC)及超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)的活力。结果与空气组比较,高氧组AECⅡ的增殖活力、S+G2期细胞比例、线粒体膜电位、SOD活力和TAOC均明显下降(P<0.01),MDA含量明显升高(P<0.01);与高氧组比较,高氧SP组AECⅡ的增殖活力、S+G2期细胞比例、线粒体膜电位、SOD活力和TAOC均明显升高(P<0.01),而MDA含量明显下降(P<0.01),SP受体拮抗剂可阻断该效应。结论 SP可明显减轻高氧导致的早产大鼠AECⅡ的氧化损伤,增强细胞的抗氧化能力,进而起到促进细胞增殖的作用。

神经肽P物质调控Notch信号通路对胎鼠高氧肺损伤后Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖的影响

【摘要】目的探讨神经肽P物质（SP）对胎鼠高氧肺损伤后Ⅱ型肺泡上皮细胞（AECI／）增殖的影响及其可能机制。方法取孕18d胎鼠肺组织进行原代AEC11分离培养后分为6组。空气组暴露于含21％的氧舱内；高氧组则暴露于含95％的氧舱内；高氧＋SP组、高氧＋SP＋SP受体拮抗剂L703．606组、高氧＋SP＋Notch信号通路阻断剂MW167组、高氧＋MWl67组在高氧暴露基础上相应加入1μmol／L的SP、0．03mmol／L的L703．606、0．2mmol／L的MW167。干预后4h检测细胞活性，于6、12、18、24h计数细胞并描绘增殖曲线，24h于倒置显微镜下观察细胞形态及增殖情况并检测细胞周期；用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT—qPCR）检测Notch信号通路配体Dll1、D114以及靶基因Hes1的mRNA表达。结果经高氧或Notch信号通路阻断剂MW167处理后，各组细胞计数均较空气组明显减少，且细胞活性明显降低，出现G1期阻滞现象，细胞增殖能力明显受抑；镜下可见核固缩、胞内颗粒物减少等变化；同时Notch通路相关基因Dll1、D114、Hes1的mRNA表达量明显下降。与高氧组比较，SP干预后细胞计数增多，胞内颗粒物质增加，且细胞活性明显升高（A值：75．5±14．9比44．9±8.4），G1期比例降低[（62．87±3．99）％比（67．47±2．28）％]、S期比例升高[（32．54±2．71）％比（25．03±3．52）％]，说明细胞增殖能力明显增强（均P〈0．05）；同时Dll1、D114、Hes1的mRNA表达量均明显上调（2^-△△Ct：1．44±0．13比0．92±0．04，0．80±0．17比0．35±0．08，1．20±0．09比0．85±0．08，均P〈0．05）。而此时再加入SP受体拮抗剂L703．606或Notch信号通路阻断剂MW167，可再次出现细胞增殖受抑的表现，且细胞活性再次降低（A值：60．0±9．5、37．7±21．7比75．5±14．9），G1期比例增加[（73．96±3．53）％、（92．44±1．75）％比（62．87±3．99）％]、S期比例降低[（20．54±2．24）％、（14．25±3．84）％比（32．54±2．71）％]，说明细胞增殖能力再次被抑制（均P〈0．05）；同时DUl、D114、Hesl的mRNA表达量明显下调（2^-△△Ct：0．65±0．01、0．49±0．15比1．44±0．13，0．07±0．01、0．27±0．03比0.80±0．17，0．59±0．11、0．48±0．06比1．20±0．09，均P〈0．05）。结论SP可能通过调控Notch信号通路表达来适当促进AECⅡ的增殖、减少其氧化损伤，从而对高氧肺损伤发挥一定的保护作用。