HIF1α特异性人源喉癌噬菌体单链抗体的制备及其对放疗增敏的实验研究

目的利用噬菌体肽库技术,构建HIF1α人源喉癌单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),研究其对放疗敏感性的影响。方法提取喉癌患者癌旁阳性淋巴结总RNA,通过RTPCR和重叠延伸PCR扩增得到可变区基因scFv,将其重组到载体pCANTAB5E中,转化至TG1大肠杆菌,以制备初级抗体库。以HEP2细胞及HIF1α纯化抗原对抗体库进行淘选。SDS-PAGE电泳检测scFv的可溶性表达,Western blot检测其对HIF1α蛋白表达的影响,ELISA和细胞免疫化学鉴定其特异性,CCK-8检测scFv联合X线照射后HEP2细胞的存活率,克隆形成实验分析scFv处理后HEP2细胞放疗存活曲线。结果成功制备HIF1α人源喉癌单链抗体scFv,SDS-PAGE电泳证实其可溶性表达且相对分子质量约为34×10~3,Western blot表明其能下调HIF1α蛋白的表达。ELISA检测到该抗体对HIF1α抗原的识别率高达79%,细胞免疫化学显示该抗体与HEP2细胞特异性结合。CCK-8检测结果显示scFv联合X线照射后,较单纯X线照射组明显降低了HEP2细胞的存活率(P<0.05),克隆形成实验结果显示scFv对放射的增敏比为1.89。结论成功构建了HIF1α人源喉癌单链抗体,且其能增加HEP2细胞对放疗的敏感性。

用于巨型脂质体制备及收集的微流控芯片研究

构建了一种集成制备和收集功能的微流控芯片系统。利用微流控技术将脂质溶液输入微电极阵列中形成脂质膜,在微电极阵列产生的聚焦电场作用下,高效形成一定粒径范围的巨型脂质体,稳定的巨型球形脂质体的最高产率可以达到60%;然后将制备的脂质体经微通道输送到收集腔室,通过重力作用和微孔滤膜的筛选可得到90%以上,尺寸在10"50#m的稳定巨型球形脂质体。此芯片系统有效地克服了目前巨型脂质体制备方法效率低、脂质体粒径分布广、难筛选和难收集等缺点。

基质金属蛋白酶-11协同14促进乳腺癌发展

目的:检测基质金属蛋白酶-11和14(MMP-11和MMP-14)在乳腺癌中的表达,探讨MMP-11对乳腺癌细胞迁移、侵袭能力的影响。方法:检测MMP-11和MMP-14在161例浸润性乳腺癌和10例正常乳腺组织中的表达;运用小干扰RNA(siRNA)将高表达MMP-11的MB-231细胞抑制MMP-11,运用Transwell小室测定其迁移和侵袭力。结果:MMP-11和MMP-14在161例乳腺癌组织中高表达(分别为122/161及149/161),两者均与乳腺癌淋巴结转移和TNM分期相关,并且MMP-11与MMP-14呈正相关,差异均有统计学意义(P<0.05);MMP-11被成功干扰后,MB-231细胞中MMP-11和MMP-14表达同时降低,并且细胞迁移、侵袭能力明显减弱,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:MMP-11和MMP-14均与乳腺癌侵袭转移相关,并且MMP-11被抑制后,能下调MMP-14从而抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭能力,它们可能成为判断乳腺癌预后的分子标志物及临床治疗靶点之一。

miR-148b/DUSP1调节巨噬细胞分泌细胞因子CD206促进肝癌的发生

目的探讨miR-148b/DUSP1信号通路调节巨噬细胞分泌细胞因子CD206的表达对肝癌发生的影响。方法利用全自动磁珠提取纯化系统提取外周血单核细胞并培养,用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)分别诱导生成M1型和M2型巨噬细胞,CD68、CD206进行表型鉴定,ELISA检测M1和M2型巨噬细胞分泌的细胞因子CD206的表达,CCK-8和Transwell实验检测巨噬细胞分泌细胞因子CD206对肝癌细胞(Hep G2和Huh7细胞)增殖、侵袭、转移的影响,双荧光素酶报告基因系统验证miR-148b与DUSP1的靶向结合。结果初步分离并鉴定M1和M2型巨噬细胞,M2型巨噬细胞分泌的细胞因子CD206促进肝癌细胞的生长和侵袭、转移,双荧光素酶报告基因证实DUSP1为miR-148b的靶基因,miR-148b/DUSP1信号通路促进肝癌的发生、发展,巨噬细胞标志物与肝癌患者的临床病理特征相关。结论 miR-148b/DUSP1信号通路影响巨噬细胞分泌的细胞因子促进肝癌发生、发展。

内皮素3基因对结直肠癌LoVo细胞迁移和侵袭能力的影响

目的探讨内皮素3(endothelin 3,EDN3)基因对结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响及其相关机制。方法实时荧光定量PCR检测EDN3 mRNA在人结直肠癌组织及对应癌旁组织中的表达情况,半定量PCR检测EDN3及内皮素受体B(endothelin receptor B,EDNRB)mRNA在结直肠癌细胞(CaCO_2、LoVo、HT-29)中的表达情况。将包装过载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-EDN3的病毒感染至结直肠癌细胞LoVo,MTS、克隆形成法、划痕法、Transwell检测EDN3对细胞增殖、克隆、迁移和侵袭能力的改变。Western blot检测LoVo中p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白改变。结果 EDN3在人结直肠癌组织和细胞中表达降低。表达EDN3基因的重组载体成功感染至LoVo细胞。MTS和克隆实验结果显示,实验组和对照组细胞增殖和克隆形成差异无统计学意义(P>0.05),划痕实验和Transwell实验提示实验组细胞迁移和侵袭能力明显低于对照组(P<0.01)。Western blot检测结果显示磷酸化的ERK1/2蛋白表达下降(P<0.01)。结论 EDN3在结直肠癌组织和细胞中表达降低,过表达EDN3能抑制结直肠癌LoVo细胞的迁移和侵袭能力,其机制可能与ERK1/2信号通路有关。

HBX在肝癌细胞中通过下调miR-199a增强AKT的表达

目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBX)调节miR-199a的表达在HBV相关性肝癌发生中的分子机制。方法重组HBX腺病毒(Ad-HBX)感染人肝癌Hep G2细胞,HBX的siRNA转染稳定表达HBV基因的人肝癌Hep G2.2.15细胞,荧光定量PCR方法检测HBV相关性肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、miR-199a、AKT的mRNA表达水平及运用Western blot检测肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、AKT的蛋白表达水平;分别用miR-199a mimics和miR-199a inhibitor的转染肝癌细胞后,荧光定量PCR方法检测肝癌细胞中AKT的mRNA表达水平及运用Western blot检测肝癌细胞中AKT的蛋白表达水平。结果 miR-199a在Hep G2.2.15细胞中表达水平显著低于Hep G2细胞,并且证实其表达下调受到了HBX的调控(P<0.05),Hep G2.2.15细胞中AKT表达水平显著高于Hep G2细胞(P<0.05),在Hep G2.2.15细胞中过表达miR-199a能明显下调AKT表达水平以及在Hep G2细胞中抑制miR-199a能明显上调的AKT表达水平(P<0.05),此外,miR-199a的表达量在HBV相关性肝癌组织比相应的癌旁组织表达降低。结论 HBX可以通过miR-199a调节AKT导致HBV相关性肝癌发生。