TGF-βⅡ型受体小分子抑制剂ITD-1对骨髓基质细胞成骨分化和血管形成的作用

目的探讨TGF-βⅡ型受体(transforming growth factor beta receptorⅡ,TGFBR2)的小分子抑制剂ITD-1对小鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)成骨分化和血管形成的影响。方法将C57/BL6小鼠BMSCs分为3组:不经药物处理为空白组;1‰DMSO处理为DMSO组;10μmol/L ITD-1处理为ITD-1组。采用CCK-8检测细胞增殖变化;流式细胞仪检测凋亡细胞比例;实时荧光定量PCR(qPCR)测定成骨标志物碱性磷酸酶(ALP)、ostrix(OSX)、Ⅰ型胶原(collagen1,COL1)和骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)及成血管相关标志物血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素1(angiopoietin1,ANGPT1)mRNA的表达;碱性磷酸酶染色检测ALP表达情况;茜素红染色检测成骨晚期矿化水平;免疫荧光染色检测成骨标志物OPN及成血管标志物VEGF的表达;小鼠组织培养实验检测体外培养小鼠肱骨骨密度。结果碱性磷酸酶染色显示ITD-1组染色变浅,茜素红染色结果提示ITD-1组钙盐结节显著减少;与DMSO组比较,ITD-1组BMSCs增殖水平显著降低;流式细胞仪检测显示10μmol/L的ITD-1不导致细胞凋亡;与DMSO组比较,ITD-1组成骨标志物ALP、OSX、COL1及OCN的mRNA相对表达量均显著降低(P<0.01),但成血管标志物VEGF和ANGPT1的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),OPN表达降低而VEGF表达升高(P<0.05),肱骨骨密度也显著降低(P<0.05)。结论TGFBR2的小分子抑制剂ITD-1可抑制骨髓基质细胞增殖,在不影响细胞凋亡的情况下对成骨分化具有显著抑制作用,但显著增强血管形成。

FSHβ在骨形态蛋白9诱导小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化中的作用研究

目的:探讨卵泡刺激素β亚基(follicle-stimulating hormoneβ,FSHβ)对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)成骨分化中的作用。方法:采用Ad Easy系统构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、FSHβ和BMP9的重组腺病毒(Ad-GFP、Ad-FSHβ和Ad-BMP9),实验分组为:AdGFP组、Ad-BMP9组、Ad-FSHβ组和Ad-BMP9+Ad-FSHβ组。运用化学发光定量和组织化学染色法分别检测各组3、5、7 d碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性;Western blot检测成骨分化早期转录因子(Runx2和DLX5)的蛋白表达水平;RT-PCR检测成骨分化晚期指标骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的m RNA表达水平;茜素红染色检测钙盐沉积;流式细胞技术检测各实验组细胞的周期分布。结果:在MEFs中,过表达FSHβ能明显促进BMP9诱导MEFs骨化过程中第3天(6 874.67±224.93 vs.11 935.67±568.76,P=0.000)、第5天(43 434.67±2 047.57 vs.98 913.33±4 606.26,P=0.000)、第7天(38 198.00±2 376.43 vs.78 534.67±2 114.56,P=0.000)的ALP活性,转录因子Runx2(1.171±0.105 vs.1.350±0.053,P=0.026)、DLX5(1.382±0.123 vs.1.738±0.286,P=0.001)和晚期成骨指标OCN(1.300±0.045 vs.1.471±0.046,P=0.002)、OPN(1.300±0.084 vs.1.479±0.038,P=0.016)的表达水平,以及钙盐沉积。此外,FSHβ和(或)BMP9对MEFs细胞周期没有明显影响(G1期:F=0.226,P=0.876;G2期:F=0.147,P=0.929;S期:F=0.027,P=0.994)。结论:在不影响MEFs细胞周期的情况下,FSHβ协同BMP9诱导MEFs成骨分化。

Wnt/β-catenin通路在FSHβ增强BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的作用研究

目的探讨Wnt/β-catenin通路在促卵泡激素β亚基(follicle-stimulating hormoneβ-subunit,FSHβ)增强骨形成蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的作用。方法C3H10T1/2细胞为研究对象,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色方法检测Ad-GFP对照组、Ad-FSHβ实验组、Ad-BMP9实验组、Ad-BMP9+Ad-FSHβ实验组或Ad-BMP9+Ad-FSHβ+XAV-939实验组等各研究组ALP表达;茜素红S染色(alizarin red s,ARS)方法检测各研究组钙盐小节沉积;实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)技术检测各研究组cyclin D1转录。结果单独的Ad-FSHβ实验组骨形成早、晚期标志物(ALP和钙盐小结)与Ad-GFP对照组相比无显著差异;单独的Ad-BMP9实验组中,两者的表达均高于Ad-GFP对照组;Ad-FSHβ与Ad-BMP9联合实验组的表达量较Ad-BMP9实验组显著增加。检测各研究组Wnt/β-catenin通路的靶基因cyclin D1的转录,与Ad-GFP对照组相比,Ad-FSHβ实验组的表达无显著变化,Ad-BMP9实验组的表达水平显著升高(P<0.01),Ad-FSHβ与Ad-BMP9联合实验组cyclin D1 mRNA表达量显著高于Ad-BMP9实验组(P<0.01)。Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV-939处理后,Ad-BMP9与XAV-939联合实验组cyclin D1 mRNA的水平较Ad-BMP9实验组下降(P<0.01),Ad-FSHβ、Ad-BMP9与XAV-939三者联合实验组水平也较Ad-FSHβ与Ad-BMP9联合实验组下降(P<0.05)。ALP的表达呈现出与cyclin D1转录相似的变化趋势。结论Wnt/β-catenin通路可能在促卵泡激素β亚基增强骨形成蛋白9诱导MSCs成骨分化中起重要作用。

FSHβ在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的作用研究

目的探讨卵泡刺激素β亚基(follicle-stimulating hormoneβ-subunit,FSHβ)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化中的作用及可能的机制。方法利用细胞化学染色方法检测处理因素(重组腺病毒或γ促分泌酶抑制剂DAPT)作用于间充质干细胞5 d后细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色的变化。通过实时定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-PCR)检测BMP9 mRNA、FSHβmRNA和Notch信号通路靶基因(Hey1) mRNA的表达水平。利用茜素红S(alizarin red S,ARS)染色检测腺病毒感染间充质干细胞21 d后细胞中钙盐的沉积情况。结果 FSHβ处理组ALP表达较GFP对照组无明显改变,BMP9处理组ALP表达较GFP对照组明显增加,而BMP9与FSHβ联合处理组ALP表达较BMP9处理组显著增加。另外,BMP9处理组晚期成骨标志物钙盐结节、Notch信号靶基因Hey1 mRNA表达水平较GFP对照组显著增加(P<0.01),而BMP9与FSHβ联合处理组较BMP9处理组表达显著增加(P<0.01)。使用药物DAPT抑制Notch信号后,BMP9与DAPT联合处理组较BMP9单独处理组,ALP染色、Hey1 mRNA表达显著降低(P<0.05);且BMP9+FSHβ+DAPT联合处理组较BMP9+FSHβ联合处理组ALP染色、Hey1 mRNA表达也显著降低(P<0.05)。结论 FSHβ可增强BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化,Notch信号通路可能在其中发挥重要作用。

Notch信号介导骨细胞过表达BMP4促进骨髓基质细胞成骨分化

目的探究骨细胞MLO-Y4过表达骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein-4,BMP4)通过Notch信号对骨髓基质细胞ST2成骨分化的影响。方法使用BMP4重组腺病毒(Ad-BMP4)以及阴性对照(Ad-GFP)分别感染MLO-Y4后与ST2共培养,分为GFP组及BMP4组;Western blot检测MLO-Y4细胞BMP4蛋白表达;采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测MLO-Y4的BMP4和Notch配体基因、共培养体系中成骨标志基因、Notch靶基因以及促血管生成因子表达;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及生化定量检测ALP活性;在共培养体系中加入Notch信号抑制剂DAPT后,再次检测上述指标。结果MLO-Y4过表达BMP4,上调Notch配体Jag1、Jag2、Dll4表达;ALP染色以及生化定量结果显示共培养第1天GFP组和BMP4组ALP活性差异无统计学意义,在第3、5天,BMP4组ALP活性更高(P<0.05);BMP4组成骨标志基因在第1天仅Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)显著升高(P<0.05),第3、5天BMP4组Alp、Runx2、骨钙蛋白(osteocalcin,Ocn)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)均显著增高(P<0.05);第3天BMP4组Notch信号靶基因Hey1、Hey2,血管内皮生长因子(vascular endothlial growth factor,VEGF)、低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α)的表达也显著增高(P<0.05);加入DPAT抑制Notch信号后,BMP4组ALP活性、成骨标志基因以及促血管生成因子表达均显著下降(P<0.05)。结论MLO-Y4过表达BMP4可以促进ST2成骨分化,该过程可能与Notch信号增强有关。

激活BMP信号的骨细胞对骨髓基质细胞成骨及成脂分化的作用研究

目的激活骨细胞系MLO-Y4细胞中BMP信号检测培养上清对骨髓基质细胞系ST2成骨、成脂分化的影响,进一步探讨其机制。方法0.5‰DMSO,0.5μmol/L BMP激动剂FK506分别处理MLO-Y424 h后,使用CCK-8检测细胞活力变化,实时荧光定量PCR检测BMP下游靶基因ID1及ID2 mRNA表达变化;用20%MLO-Y4培养上清与80%新鲜培养基混合后培养ST2细胞,分为DMSO组、FK506组。碱性磷酸酶染色代表其成骨分化能力,通过实时荧光定量PCR检测碱性磷酸酶(ALP)、骨钙蛋白(OCN)、骨唾液酸蛋白(BSP)、Runx2等成骨细胞标志基因,过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ)和C/EBP成脂分化标志基因。免疫印迹试验(Western blotting)检测ST2细胞内Wnt信号下游β-catenin、BMP信号下游p-smad5蛋白表达水平。结果与DMSO作用的MLO-Y4细胞相比,FK506激动的MLOY4细胞内BMP信号靶基因ID1、ID2上调,但不影响细胞活力。FK506组ST2细胞同DMSO组对比,成骨分化相关标志物,包括ALP、OCN、BSP、Runx2(P<0.001)均显著升高;成脂分化标志物PPARγ及C/EBP表达则显著降低(P<0.001);ST2细胞内β-catenin蛋白表达量上调(P<0.05)。结论BMP信号激动后MLO-Y4细胞上清可以促进ST2细胞成骨分化、抑制成脂分化,其成骨能力增强与细胞内Wnt信号增强有关。

INH-α对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的作用

为了研究抑制素α亚基(inhibinα-subunit INH-α)对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein9,BMP9)诱导的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的影响,本研究采用细胞化学染色法检测第3天、第5天、第7天细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的变化。利用RT-PCR和Western blotting检测细胞中的成骨分化早期标志物(Runx2)和晚期标志物(OPN)的mRNA含量及蛋白表达水平。茜素红S染色法检测第21天细胞中的钙盐沉积变化。发现BMP9组ALP活性明显增高,INH-α组ALP活性与对照组相比无明显变化,但联合运用BMP9和INH-α组ALP活性较BMP9组明显降低。此外,BMP9组Runx2和OPN的mRNA含量和蛋白表达水平明显增高,而联用BMP9和INH-α组中的Runx2和OPN水平较BMP9组显著下降(p<0.01)。同样,在茜素红S染色实验中,BMP9组钙盐结节明显增多,染色深;而在联合运用BMP9和INH-α组钙盐结节较BMP9组明显减少,染色变浅。说明INH-α能够抑制BMP9诱导间充质干细胞成骨分化作用。