基质金属蛋白酶抑制剂1和2siRNA对CCl4诱导的肝纤维化大鼠Smad7蛋白表达的影响

目的:研究基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP)1和2的siRNA对CCl4诱导的肝纤维化大鼠Smad7蛋白表达的影响。方法:采用前期构建的TIMP-1 siRNA、TIMP-2 siRNA治疗肝纤维化大鼠的肝脏组织作为研究对象,分为正常组、模型组、阴性对照组(0.25 mg/kg非特异性靶序列)、TIMP-1 siRNA 0.25 mg/kg组和TIMP-2 siRNA 0.25 mg/kg组。Real-time PCR法检测Smad7的mRNA表达;免疫组织化学、Western blot检测Smad7的蛋白表达。结果:Real-time PCR结果显示TIMP-1 siRNA 0.25 mg/kg组(59.7±3.3)%、TIMP-2 siRNA 0.25 mg/kg组(60.2±3.4)%Smad7的mRNA表达量均较模型组(28.0±1.6)%、阴性对照组(28.6±1.7)%明显增加(P=0.000);免疫组织化学结果显示TIMP-1 siRNA 0.25mg/kg组(8.55±0.67)、TIMP-2 siRNA 0.25 mg/kg组(8.23±0.85)Smad7的蛋白表达量均较模型组(4.25±0.53)、阴性对照组(4.19±0.55)明显增加(P=0.000)。Western blot结果显示TIMP-1 siRNA 0.25 mg/kg组(0.706±0.039)、TIMP-2 siRNA 0.25 mg/kg组(0.698±0.038)Smad7的蛋白表达量均较模型组(0.278±0.013)、阴性对照组(0.285±0.014)明显增加(P=0.000)。结论:TIMP-1 siRNA、TIMP-2siRNA对于肝纤维化Smad7的表达有促进作用。

人肝再生增强因子真核表达及其对顺铂诱导肝癌细胞凋亡的影响

目的:构建人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,h ALR)15k D亚型的真核表达系统,并探索ALR对顺铂(Cisplatin,DDP)诱导的人肝癌细胞株QGY凋亡的影响。方法:用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法和基因重组技术,从重组质粒p PIC9K-rh ALR中扩增出编码rh ALR基因片段,将其克隆入p PICZαA质粒中构建重组质粒p PICZα-A-rh ALR。重组质粒SacⅠ酶切线性化后电转入酵母GS115中,并在1%的甲醇诱导下表达。表达上清蛋白经Western blot(ALR多克隆抗体和His-tag标签抗体)鉴定和镍柱亲和层析纯化。MTS试剂检测rh ALR体外对人肝癌细胞(Hep G2、QGY)的促增殖活性,及流式细胞仪检测rh ALR在顺铂诱导QGY细胞凋亡中的抗凋亡作用。结果:PCR、双酶切、DNA测序均鉴定重组质粒构建与预期一致。分泌表达的rh ALR约占上清总蛋白的70%,目的分子量约17 k D,Western blot均可见单一条带。纯化后的rh ALR对Hep G2和QGY的体外促增殖作用呈浓度依赖性增强(Hep G2组:F=246.729,P=0.000;QGY组:F=246.004,P=0.000),且在QGY细胞顺铂诱导凋亡时也发挥着浓度梯度式抗凋亡作用(F=101.061,P=0.000)。结论:成功构建高效分泌表达rh ALR的p PICZα-A-rh ALR GS115真核表达系统;体外实验证实rh ALR对顺铂诱导人肝癌细胞有呈浓度依赖性的抗凋亡作用。

慢性乙型肝炎患者12周白发性HBV DNA水平变化分析

目的分析慢性乙型肝炎患者12周内自发性HBV DNA水平下降情况。方法回顾性分析2003～2005年未接受抗病毒药物治疗的慢性乙型肝炎患者12周内白发性HBV DNA水平下降情况，并根据患者基线ALT、总胆红素（TBil）水平进行分组，分析基线ALT、TBil对自发性HBV DNA水平下降的影响。两组间计量资料比较采用t检验或Wilcoxon符号秩和检验；多组数据均值比较采用方差分析；组间率的比较采用χ^2检验。结果共收集213例慢性乙型肝炎患者，男性174例，女性39例，年龄18～65（33．0±10．0）岁。其中慢性乙型肝炎轻～中度124例，慢性乙型肝炎重度89例；12周时失访19例（8．92％）。所有患者HBV DNA基线均值为（6．66±1．03）log10拷贝／ml，12周时为（5.98±1．53）log10拷贝／ml（P〈0．01）。慢性乙型肝炎重度患者基线时HBV DNA水平均值低于慢性乙型肝炎轻～中度患者，分别为（6．45±0．99）log10拷贝／ml与（6．81±1．04）log10拷贝／ml（P〈0．05）；但两组12周时HBV DNA水平均值及HBV DNA水平下降值的差异均无统计学意义。12周时HBV DNA≤3log10拷贝／ml患者的基线ALT及TBil值高于HBV DNA〉3log10拷贝／ml组，但差异均无统计学意义。12周时HBV DNA水平下降值≥2log10拷贝／ml与〈2log10拷贝／ml两组患者的基线ALT、TBil水平相近（P〉0．05）。基线ALT水平≤5倍正常值上限（ULN）与〉5×ULN两组患者12周时HBV DNA水平均值及HBV DNA水平下降值的差异均无统计学意义；两组患者12周时HBV DNA≤3log10拷贝／ml、HBV DNA水平下降值≥2log10拷贝／ml的比例，差异也无统计学意义（P〉0．05）。基线时ALT≤5XULN及TBil≤5×ULN组HBV DNA水平均值高于其他3组（P〈0．05），但12周时各组HBV DNA水平均值、HBV DNA下降值比较，差异无统计学意义。结论慢性乙型肝炎患者12周内存在一定程度的白发性HBV DNA水平下降，但肝脏炎症损伤程度与患者12周内自发性HBV DNA水平下降程度无明显的相关性。