TALE-TFs构建方法的建立及优化

目的在传统方案的基础上建立一种经济有效且易于操作的类转录激活效应子转录因子(TALE-TFs)的构建和功能检测方案。方法采用基于PCR的Golden gate克隆法分别尝试构建类转录激活效应物(TALEs)的六聚体、五聚体、四聚体和三聚体,比较构建结果,选择最优效果方案进行TALE-TFs的构建。采用片段置换反应(FSR)构建了含有TALE-TFs结合片段的RFP质粒pminCMV,并与TALE-TFs进行共转染,观察红色荧光验证TALE-TFs的转录活性。结果 TALEs中所含的串联重复模块越少,获得的构建产物越多。共转染时,TALE-TFs使得pminCMV成功启动表达。结论该研究为不同条件下实验方案的选择提供了依据,并利用含有TALE-TF结合片段和红色荧光的质粒建立了快捷直观的转录活性验证方法。

重组腺病毒Ad-mALR和Ad-hALR的构建及其对棕榈酸(PA)诱导的L02细胞凋亡的影响

目的构建含肝再生增强因子(ALR)基因的重组腺病毒并探讨其抗凋亡功能。方法采用基因重组法构建重组穿梭载体p Ad Track-TO4-m ALR和p Ad Track-TO4-h ALR,同源重组法构建重组腺病毒Ad-GFP-m ALR和Ad-GFP-h ALR,4轮扩增后获得高滴度Ad-GFP-m ALR和Ad-GFP-h ALR。将上述腺病毒感染L02细胞,通过绿色荧光蛋白(GFP)的表达了解其感染率;Western blotting法检测ALR及Bcl-2/Bax蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测ALR对棕榈酸(PA)诱导的L02细胞凋亡的影响。结果重组腺病毒Ad-GFP-m ALR和Ad-GFP-h ALR构建成功,且均能高效感染并稳定表达于L02细胞。与非感染组和感染空载病毒组相比,过表达ALR能促进L02细胞的增殖,并抵抗PA诱导的L02细胞凋亡作用,明显降低Bax,增加Bcl-2蛋白的表达。结论 ALR对L02细胞具有促增殖及抗PA诱导的细胞凋亡的作用。

RNA干扰技术用于抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和核心抗原的小干扰RNA(siRNA)表达载体pSuper-C,观察其对HepG2 2.2.15细胞(简称2.2.15细胞)中HBV DNA转录和翻译相应蛋白的影响。 方法 根据RNA干扰(RNAi)作用原理设计针对HBV核心区的相应序列,再将其克隆人含聚合酶ⅢH 1-RNA启动子的真核表达载体pSuper,将此重组质粒以电转染法转入2.2.1 5细胞中,用酶联免疫吸附法(Abbott试剂)检测培养上清液中HBsAg和e抗原(HBeAg)的表达。 结果 经酶切鉴定、电泳和测序分析证明,成功构建了含作用序列的重组质粒pSuper-C;但以电穿孔法转染2.2.15细胞后未能发现其对2.2.15细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg的表达有影响。 结论 RNAi在2.2.1 5细胞中的作用还需进一步的实验来证实。

SM22启动SCAP真核表达质粒的构建及其在CHO细胞中的表达

为建立平滑肌特异的固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的裂解激活蛋白(SCAP)超表达的转基因小鼠,深入探讨SCAP的功能,本实验构建了由平滑肌特异蛋白SM22启动子(pSM22)启动仓鼠SCAP443位点突变体——SCAP(D443N)的真核表达质粒,并在仓鼠卵巢细胞(CHO)验证其表达。利用巢式PCR从小鼠肝脏组织提取的基因组中扩增得到pSM22基因。先将其插入pMD-T载体,构建T-SM22,对pSM22测序后,通过双酶切将pSM22克隆到pGL3-control-Luc中,成为pGL3-SM22-Luc。转染pGL3-SM22-Luc到血管平滑肌(VSMCs)中,通过检测荧光素酶(Luc)值观察pSM22在VSMCs内的启动活性。利用PCR从pTK-HSV-SCAP(D443N)质粒中扩增出SCAP(D443N)后克隆入pGL3-control中,成为pGL3-SCAP。然后再将pSM22克隆入pGL3-SCAP中,成为表达质粒pGL3-SM22-SCAP(D443N)。转染表达质粒到CHO细胞,用real-timePCR和Western blotting验证SCAP(D443N)的表达。结果证实pSM22在体外VSMCs中能启动Luc的表达;表达质粒pGL3-SM22-SCAP(D443N)酶切及测序结果正确;将其转染到CHO细胞后,与转染pGL3-control的对照细胞相比SCAP(D443)mRNA和蛋白表达显著增强。

炎症干扰胆固醇调节元件结合蛋白2致ApoE/SRA/CD36三基因敲除小鼠肝脏脂质的异常积聚

目的 研究炎症是否通过干扰核转录因子胆固醇调节元件结合蛋白2（SREBP-2）而致ApoE/SRA/CD36三基因敲除小鼠肝脏胆固醇的异常积聚.方法 将8周龄ApoE/SRA/CD36三基因敲除雄性小鼠随机分为对照组（n=8）和炎症组（n=8）,2组均喂以西方饮食（Western diet）,炎症组小鼠皮下注射10%酪蛋白建立慢性炎症模型,对照组注射相应量磷酸盐缓冲液,14周后处死,测定血清中炎症介质和脂质的水平及肝组织中胆固醇含量,油红O、免疫组织化学染色后观察肝脂质沉积程度以及组织形态变化,实时定量PCR法检测肝脏SREBP裂解激活蛋白（SCAP）、SREBP-2及其下游基因低密度脂蛋白受体（LDLr）mRNA水平.对计量资料采用两样本均数比较的t检验进行统计学分析.结果 炎症状态下,血清中总胆固醇[（7.72±1.70）mmol/L]、低密度脂蛋白胆固醇[（2.94±0.44）mmol/L]、高密度脂蛋白胆固醇[（2.24±0.63）mmol/L]水平均显著降低,与对照组[分别为（13.23±3.61）mmol/L、（9.28±3.66）mmol/L、（4.13±0.42）mmol/L]比较,t值分别为3.383、4.245、5.937,P值均＜0.05;肝组织中胆固醇含量显著增加;油红O染色表明,胆固醇在肝脏中的沉积异常增多（t=2.707,P＜0.05）;实时定量PCR和免疫组织化学检测结果表明胆固醇代谢相关基因SREBP2、LDLr和SCAP的mRNA和蛋白质表达水平显著增加. 结论炎症可以通过干扰SREBP-2导致低密度脂蛋白胆固醇摄取异常,造成肝脏脂质沉积增多和损害.

RNA干扰技术用于肝病治疗的研究

近年来,病毒性肝炎的治疗研究有了长足的进展,特别是干扰素和抗病毒核苷类药物不断有新的发现,但其疗效仍有不尽人意之处.随着人类基因组计划的完成,基因治疗的领域不断拓展,抗病毒性肝炎及相关肝病的基因治疗研究又有了相应的发展,其中RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术的出现为病毒性肝炎抗病毒治疗研究提供了新的选择.

肝再生增强因子对大鼠腹腔移植的肝细胞的影响

目的探讨肝再生增强因子（ALR）对急性肝功能衰竭大鼠腹腔移植的肝细胞的影响。方法采用D-氨基半乳糖诱导SD大鼠急性肝功能衰竭（AHF），然后将其随机分为空白对照组（仅接受生理盐水腹腔注射）、移植对照组（腹腔移植SD大鼠的肝细胞2×10^7个）、环孢素A组（CsA组，接受肝细胞移植后腹腔注射CsA6d）、ALR组（接受肝细胞移植后腹腔注射ALR6d）和ALR对照组（仅腹腔注射ALR6d）。实验期为14d，观察受者的存活情况及移植肝细胞存活情况，检测腹腔内细胞CD4、CD8及CD68的表达情况，测定血清及腹腔冲洗液中白细胞介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNFα）的水平。结果空白对照组、移植对照组、CsA组、AL，R组及ALR对照组的受者2周存活率分别为0、46．7％、20％、66．7％和14．3％，ALR组显著高于空白对照组（P=0．001）。移植后1～2d，ALR组血清TNF-α和IL-1β明显低于空白对照组和移植对照组（P〈0．01）；移植对照组腹腔冲洗液中TNF-α和IL-1β水平明显高于其它各组（P〈0．05，P〈0．01）。至移植后14d，各组存活大鼠的血清TNF-α和IL-1β水平接近正常水平。移植后1～2d，ALR组移植物内CD68表达水平为（0．5±0．3）％，明显低于移植对照组和CsA组（P〈0．01）；ALR组腹腔内细胞CD68、CD4及CD8表达水平分别为（1．3±1．2）％、（0．1±0．3）％和（0．2±0．1）％，均明显低于移植对照组（P〈0．01，P〈0．01，P〈0．05）。移植后1～3d，接受肝细胞移植的大鼠腹腔内可见聚集成团的肝细胞结节，ALR组存活的肝细胞数明显多于移植对照组和CsA组，且炎症细胞浸润较少，至移植后14d，仅ALR组可见少量形态正常的肝细胞。结论腹腔内肝细胞移植联合ALR腹腔注射能提高AHF大鼠的存活率；ALR能短期改善移植肝细胞的存活状况。