丙型肝炎病毒核心蛋白稳定表达肝癌细胞株的构建及生物学研究

旨在构建稳定表达HCV核心蛋白的稳定细胞系Huh7-Core并进行初步的生物学功能研究。利用PCR技术扩增HCV核心蛋白基因,通过酶切连接反应将目的基因克隆至载体pSEB-3Flag中,将重组质粒pSEB-3F-Core和辅助质粒pAmpho共转染Huh7细胞,经过Blasticidine抗性筛选,建立稳定表达HCV核心蛋白的肝癌细胞系Huh7-Core。采用RT-PCR、Western blot鉴定Huh7-Core细胞株中核心蛋白的稳定表达并采用MTS、结晶紫试验观察Huh7-Core稳定细胞株的增殖情况。结果显示,成功构建了表达HCV核心蛋白的稳定细胞株Huh7-Core。结晶紫、MTS试验证实Huh7-Core细胞较Huh7-3Flag细胞增殖速度增快,表达HCV核心蛋白的Huh7-Core稳定细胞株构建成功,Core稳定表达后可促进Huh7细胞生长速度。

2009年版欧洲肝病研究学会乙型肝炎防治指南要点介绍

随着近10年来大量核苷（酸）类似物被应用于临床抗乙型肝炎病毒（HAY）的治疗，使该领域获得巨大的进展，但耐药性问题也日益突出。因而，核苷（酸）类似物抗HBV治疗的个体化方案、疗程、终点及治疗中耐药性的防治便成为广泛关注的热点问题。欧洲肝病研究学会新近发布了乙型肝炎治疗指南，现就其要点作一简单介绍。

乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭抗病毒治疗的研究进展

1995年Ohnishi等[1]首次提出慢加急性肝衰竭（ACLF）,即慢性肝病和急性肝脏损伤同时发生。世界上不同组织对ACLF的定义存在差异。2009年亚太肝病学会对ACLF定义[2]：在既往诊断或者未诊断的隐匿性慢性肝病的基础上,急性发病后4周内出现明显的黄疸和凝血功能障碍,伴有腹腔积液和（或）肝性脑病,其诊断标准是：

HMGB1在病毒性疾病中的研究进展

高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)在细胞内外的功能各异,胞内主要表现为DNA分子伴侣作用;胞外则作为损伤相关分子模式的成员之一具有致炎性。近年,由于HMGB1的这两种功能,在病毒性疾病中逐渐受到重视。本文根据HMGB1在乙型病毒性肝炎、人类免疫缺陷病毒性疾病、登革热、流感等疾病中作一综述。

乙型肝炎病毒转录调控的研究进展

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)基因组由一个约3.2 kb的环形DNA组成,包含了C、P、S和X 4个基因开放读码框、4个启动子和2个增强子,基因组开放读码框相互重叠,所有转录调控元件均隐含在基因编码序列中,病毒DNA序列达到高效重复利用。而HBV新的调控元件和正链转录体,以及转录后调节元件的发现,则为以后的研究提供了新的思路。

丙型肝炎病毒核心蛋白对Wnt信号抑制因子SFRPs甲基化修饰的影响

目的探讨丙型肝炎病毒核心蛋白是否通过对Wnt信号抑制因子SFRPs的甲基化修饰,从而活化Wnt信号通路。方法将编码HCV核心蛋白的腺病毒(AdCore)或GFP对照腺病毒(AdGFP)感染SMMC-7721细胞,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测SFRPs基因mRNA的表达;用5-氮杂-2'-脱氧胞苷(DAC)对AdCore或AdGFP腺病毒感染的SMMC-7721细胞进行去甲基化处理,进一步采用甲基化特异性PCR(MSP)和DNA甲基化测序,检测SFRPs基因启动子区CpG岛的甲基化程度,Western blot检测甲基化转移酶Dnmts的表达。结果在HCV核心蛋白过表达的SMMC-7721细胞系中,SFRP2和SFRP5基因mRNA的表达量与对照组相比明显降低(P<0.05);甲基化分析结果表明:SFRP5基因启动子区CpG岛呈现高甲基化修饰;甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a表达量增加(P<0.05)。结论 HCV核心蛋白可以促进SFRP5基因启动子区CpG岛的甲基化修饰,参与HCV相关疾病的发生。

2型登革病毒ns1基因克隆及其表达产物的生物学特性研究

目的克隆并表达2型登革病毒非结构蛋白ns1基因片段,初步鉴定重组蛋白的生物学特性。方法利用登革热2型病毒重组质粒,经PCR方法扩增出ns1全长基因片段,在pQE30表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用鼠抗登革病毒免疫血清对重组蛋白进行Western Blot及ELISA鉴定。结果构建的重组质粒pQE-30/NS1,pQE-30/NS1-N,pQE-30/NS1-80-200aa和pQE-30/NS1-C经IPTG诱导,重组蛋白高效表达并纯化成功,经Western Blot及ELISA证实重组蛋白可以被免疫血清特异识别。结论2型登革病毒结构蛋白表达载体在大肠杆菌SG13009中高效表达。纯化产物具有较强的免疫原性,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定了基础。

丙型肝炎病毒重要编码蛋白重组腺病毒载体的构建

旨在构建含HCV core、E1、E2、F、NS3、NS5a和NS5b基因的重组腺病毒载体。运用PCR技术扩增目的基因片段,通过酶切连接方法将上述7种基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-TO4中,然后将重组质粒用PmeⅠ线性化后与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌中同源重组。用PacⅠ酶把重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞后产生重组腺病毒颗粒。利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP对其感染效率进行监测。结果显示,酶切鉴定和测序结果均证实含core、E1、E2、F、NS3、NS5a和NS5b基因的重组腺病毒构建成功,在感染的Huh7细胞中观察到绿色荧光蛋白GFP。成功制备了高滴度的腺病毒Ad-core、Ad-E1、Ad-E2、Ad-F、Ad-NS3、Ad-NS5a和Ad-NS5b,为后续研究奠定了基础。

SARS抗病毒研究进展

严重急性呼吸综合征 (SARS)是近年来出现的严重危害人类健康的疾病 ,作为一种传染病 ,我们必须加强病因治疗。对付SARS的病原体———SARS_CoV ,传统的抗病毒药物有一定作用 ,新的基因治疗方法也很有潜力。本文就SARS的抗病毒研究现状作简要综述。

乙型肝炎病毒正链负性调节元件的亚元件鉴定

目的研究乙型肝炎病毒正链负性调节元件（HBVnt453～250）中存在的重要功能亚元件。方法通过构建pHBVnt453～250质粒一系列缺失10 bp的突变体,与内参pRL-TK质粒共转染HepG2细胞,于转染后48 h检测荧光素酶活性并确定亚元件的位置和序列。构建亚元件与pGL3-control载体质粒的重组质粒,与内参pRL-TK质粒共转染HepG2细胞并检测荧光素酶活性,半定量RT-PCR检测荧光素酶的mRNA水平。结果与pHBVnt453～250对照组比较,6个缺失突变体实验组的荧光素酶活性恢复到60%～80%,鉴定出3个功能亚元件。这3个亚元件的重组质粒荧光素酶活性比pGL3-control对照组降低,半定量RT-PCR显示荧光素酶的mRNA水平降低。结论HBVnt453～250序列中含有3个重要功能亚元件,以协同的方式发挥调节抑制作用。

慢性乙型肝炎功能治愈可预测性及持续性分析

HBsAg清除作为慢性乙肝理想的治疗终点能显著减少肝硬化、肝癌以及肝源性死亡的发生风险。然而,极少的患者能获得功能治愈(HBsAg清除),且不同的治疗方式及疗程也是影响功能治愈的重要因素。自发性及NAs诱导的HBsAg清除在慢性乙肝人群中极为罕见,而基于Peg-IFN的治疗能有效提高HBsAg清除率,故识别HBsAg清除的优势人群能挑选更适合的治疗人群、提高慢性乙肝功能治愈。此外,HBsAg清除后的持久性和临床结局已成为研究人员和临床医生关注的热点。故本文从慢性乙型病毒性肝炎功能治愈的可预测性、持久性以及预后等方面展开论述。

调节性T细胞在肝再生增强因子免疫抑制机制中的作用研究

目的观察人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)对体外活化的单个核细胞中调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的增殖、分化及抑制性细胞因子TGF-β1、IL-10表达水平的影响,探讨ALR的免疫抑制机制。方法梯度离心分离正常人外周血单个核细胞(human peripheral blood monoclear cells,PBMCs),分为对照组(Control组)、ConA刺激组(ConA组)和人ALR(hALR)干预组(ConA+hALR组)。ConA组和ConA+hALR组分别给予ConA(5μg/mL)和hALR(30μg/mL)处理,对照组不处理。各组作用60 h后,2-对磺酸基苯基-3-(4,5-二甲基噻唑)-5-(3-羧甲氧基苯基)-二氢四唑嗡盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt,MTS]检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测各组CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞比例和细胞周期变化,Real-time PCR检测各组FoxP3 mRNA的表达,ELISA检测各组上清中细胞因子TGF-β1、IL-10浓度。结果 hALR能明显抑制ConA活化的PBMCs的增殖(P<0.01);与ConA组和Control组相比,hALR能显著增加CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞占CD4+T细胞的比例(P<0.01)和FoxP3 mRNA的表达(P<0.01),并且hALR能够解除ConA引起的Treg细胞周期G2/M期的阻滞(P<0.01)。此外,与ConA组和Control组相比,ConA+hALR组上清中TGF-β1和IL-10的浓度明显升高(P<0.01)。结论hALR可以通过诱导Treg细胞的增殖、分化以及促进TGF-β1和IL-10的产生,从而达到免疫抑制的作用。

HMGB1在脓毒症中的致病机制及靶向治疗前景

高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)是机体一种重要的晚期炎症介质。近年来,因发现其在脓毒症等多种疾病中发挥重要的致病作用而成为研究热点。胞浆中HMGB1主要由活化的单核/巨噬细胞和坏死细胞释放,其本身可作为炎症介质并通过靶细胞信号传导通路刺激多种炎症介质释放,使机体炎症反应增强。HMGB1随着研究不断取得进展,其靶向治疗有望在脓毒症临床治疗中取得新突破。

抗2型登革病毒M蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的克隆表达2型登革病毒M蛋白,用纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备可用于胶体金快速检测试条的抗2型登革病毒M蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法利用登革热2型病毒全长基因重组质粒,经PCR方法扩增出prm/m基因片段,在pET-32a(+)表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用于免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗M蛋白的mAb,采用间接ELISA方法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定mAb相对亲和力。结果获得2株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞Ⅲ1A6和Ⅲ3D2;相对亲和力均在105以上。Western blot显示2株mAb能特异识别重组M蛋白。结论成功地制备出抗登革病毒2型病毒M蛋白的2株mAb,为建立快速特异检测登革病毒的实验方法提供了有力的工具。

体外鉴定汉坦病毒包膜糖蛋白G2与β3整合素的相互作用

根据汉坦病毒76-118株M基因和β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒M56和Hela细胞cDNA为模板通过PCR扩增和基因重组获得G2蛋白膜外区81～140片段的GST融合表达质粒以及β3整合素膜外区23～133片段FLAG融合表达质粒。通过SDS-PAGE检测G2片段在BL21表达菌中诱导表达及纯化的效果,Western blot检测β3整合素片段在真核细胞中的表达。将在BL21裂解上清中表达的G2蛋白N端81～140位氨基酸片段(G2N81～140)纯化后与经过GST蛋白预处理的含有β3整合素片段的细胞裂解上清进行孵育,同时以未做任何转染的HEK293细胞裂解上清和无关蛋白GST-TLM作为阴性对照,通过GSTPull-down验证G2蛋白与β3整合素之间的相互作用。结果显示在Pull-down所获蛋白复合物中检测到β3整合素27～133位氨基酸片段产物的存在。结果表明G2蛋白与β3整合素之间可能存在有直接的相互作用,为β3整合素作为汉坦病毒细胞膜受体提供了进一步证据。

重组大鼠肝再生增强因子抑制庆大霉素诱导的肾小管上皮细胞凋亡的机制研究

目的:探讨重组大鼠肝再生增强因子(rrALR)在体外对庆大霉素(GM)诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)凋亡的影响及其作用机制。方法:将NRK-52E细胞分为正常对照组、庆大霉素处理组(GM1.6g/L)和rrALR干预组(分别加入GM和不同浓度的rrALR),培养细胞24h、48h。吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色、DNA琼脂糖凝胶电泳及Annexin V/PI双染流式细胞术检测各组细胞的凋亡状态。Western blotting和RT-PCR检测各组细胞不同时点Bcl-2和Bax蛋白、mRNA的表达。结果:(1)rrALR对庆大霉素诱导的NRK-52E细胞凋亡具有抑制作用(P<0.05)。(2)rrALR能够呈剂量依赖方式增加细胞Bcl-2蛋白及核酸的表达(P<0.05)、降低细胞Bax蛋白及核酸的表达(P<0.05),使Bcl-2/Bax比值升高(P<0.05)。结论:rrALR可以通过调节Bcl-2家族Bax和Bcl-2蛋白及核酸的表达水平,抑制庆大霉素诱导的肾小管上皮细胞凋亡,减轻肾毒性药物对小管上皮细胞的损伤。

sCD40L联合TB.HSP70-H22肽刺激树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫的研究

目的探讨受sCD40L与结核杆菌HSP70(mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,TB.HSP70)-H22肽联合刺激的树突状细胞(dendritic cell,DC)在体内外的特异性抗肿瘤免疫。方法取小鼠骨髓于培养第7天分为未刺激组、sCD40L组、TB.HSP70-H22肽组、sCD40L+TB.HSP70-H22肽组,共4组,分别给予相应干预,24 h后取上清,ELISA法检测IL-12、IL-10,流式细胞术检测CD40、CD80,混合淋巴细胞反应(MRL)检测淋巴细胞增殖,MTT法检测对肿瘤细胞的杀伤率;建立小鼠肝癌模型,完全随机分为5组(分别给予生理盐水和以上4种干预获得的DC干预),Ⅰ组:生理盐水对照组,Ⅱ组:未刺激DC治疗组,Ⅲ组:sCD40L DC治疗组,Ⅳ组:TB.HSP70-H22肽DC治疗组,Ⅴ组:sCD40L+TB.HSP70-H22肽DC治疗组,于第21天测瘤质量,ELISA法测血清IL-10、IFN-γ。结果sCD40L+TB.HSP70-H22肽组的各项指标与其他各组相比,IL-10显著降低,其他指标均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。Ⅴ组与其他各组相比,IL-10和瘤质量均显著降低,IFN-γ显著上升,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论受sCD40L与TB.HSP70-H22肽复合物联合刺激后的DC被充分激活,能诱导强有力的特异性抗肿瘤细胞免疫,对H22瘤细胞产生强大的杀伤作用,显著抑制肿瘤的生长。

RNA干扰及其在肿瘤研究中的应用进展

近年来RNA干扰 (RNAi)已成为分子生物学研究领域的新热点 ,其作用机制也逐渐阐明 ,RNAi技术已广泛应用于许多研究领域 ,尤其是在肿瘤方面 ,取得了一些突破性进展 ,为今后肿瘤疾病基因治疗开辟了一条新的有效途径。

一个约30kD膜蛋白作为汉坦病毒候选受体的筛选

目的:筛选汉坦病毒包膜糖蛋白G2可能的候选受体或受体辅助分子,方法:根据汉坦病毒76～118株M基因序列设计引物,PCR扩增和基因重组获得G2全长及各功能片段的GST融合表达质粒,SDS-PAGE检测它们在BL21菌中诱导表达及纯化的效果。生物素标记汉坦病毒易感细胞Vero E6和非允许细胞CHO的细胞膜蛋白。将在BL21裂解上清中有表达的G2蛋白N端81～140位氨基酸片段(G2N81-140)纯化后与含有生物素标记的Vero E6细胞膜裂解液进行孵育,同时以非允许细胞CHO和无关蛋白GST-TLM做为阴性对照,通过GST Pull-down分离与G2蛋白特异性结合的细胞膜蛋白。结果:一个约30kD的Vero E6细胞膜蛋白与G2N81～140片段之间存在着特异性的相互作用。结论:该30kD蛋白可能是汉坦病毒细胞膜候选受体或受体辅助分子之一,是病毒入侵细胞的一个相关分子。

肝再生增强因子的生物学作用研究进展

肝再生增强因子(ALR)是近年来发现的一种新型的能促进肝脏再生和生长的细胞因子。目前对肝再生增强因子各方面都进行了比较深入的研究,尤其在生物学作用研究中发现了其在肝再生以外的很多功能。现就其生物学作用方面的研究进展作一综述。