露螽属四种昆虫Cy tb基因序列及系统进化研究(直翅目,露螽科)

研究了露螽属4种昆虫线粒体细胞色素b基因(Cytb)的部分序列,分析了核苷酸序列组成与变异及氨基酸差异。在得到的4 32bp序列中,A +T约占6 6 9% ,其中10 2个核苷酸位点发生了变异(约2 3 8% ) ,从每个氨基酸密码子来看,第3位点的A +T含量较高,为79 7%。Cytb基因编码的14 4个氨基酸由19种氨基酸组成,有12个发生了变异,占氨基酸总数的8 33% ,其中亮氨酸(Leu)与苯丙氨酸(Phe)的含量较高,谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)与精氨酸(Arg)的含量较低,无半胱氨酸(Cys)。以日本纺织娘和中华螽斯为外群构建的NJ分子系统树显示,镰尾露螽与齿尾露螽是分化较晚的类群,其次是瘦露螽,黑角露螽是分化较早的类群。

基因功能研究策略在病原真菌中的应用

昆虫病原真菌是病原真菌中一个大的类群,寄主达5目24科200余种昆虫。以昆虫病原真菌为主的杀虫剂在害虫的生物防治中起着重要的作用,其致病机制一直被人们广泛的研究。随着后基因组时代的到来,大规模基因的功能研究正成为热点,为进一步阐明病原真菌致病机理奠定了基础,因此,基因功能的分析方法也日趋成熟和多样化。对RNA干涉、基因敲除、生物信息学等基因功能分析策略的特异性和优缺点及其在病原真菌中的应用进行了综述。

奉节脐橙果实苯丙氨酸解氨酶活性及其基因表达与果皮褐变的关系

柑橘果皮褐变严重影响果实的商品价值和耐贮性。以奉节脐橙(CitrussinensisOsbeck)果实为材料,通过采后常温、涂蜡、低温、机械损伤等处理研究了果实果皮褐变率、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性及PAL基因在果皮褐变过程中表达水平的变化。结果表明,涂蜡、损伤处理均极显著地提高果实的果皮褐变率,而低温贮藏可显著降低其发生率;贮藏期间各处理的PAL活性均呈上升趋势,损伤处理PAL活性显著高于对照。果实发生褐变或受到机械损伤后,PAL2、PAL6基因的表达均比对照明显增强。结果首次表明脐橙果实PAL活性变化以及PAL2基因的表达与果皮褐变具有非常密切的关系。

柑桔溃疡病菌PCR快速检验检疫技术研究

柑桔溃疡病是严重影响全世界柑桔生产的重大检疫性病害,根据柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)新近公布的全基因组中独有的保守蛋白基因序列,设计筛选出一对种特异性引物(JYF5/JYR5),能专一地扩增检出柑桔组织表面所带溃疡病菌的DNA靶带(413 bp)。而柑桔叶面附生的非致病性黄单胞菌、野油菜黄单胞菌近缘种以及健康柑桔样品都不能扩增;靶细菌DNA检测下限1.56 pg/μL,靶细菌悬浮液检测下限10 cfu/μL;在不同PCR仪及各种控温方式下都能稳定地扩增出特征性靶带。这一特异、准确的柑桔溃疡病菌PCR检验技术和研制的预包被固相化PCR检测试剂盒已开始用于我国非疫生产区建设中柑桔苗木、果实的病害检疫检验。

食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究

传统微生物检测方法耗时长、灵敏性差,难以满足食品安全快速检测要求,建立和完善食品中致病微生物快速检测技术具有重要的现实意义.本研究针对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌,根据其特异基因设计出4对引物,通过对食品样品进行梯度离心处理、改良异硫氰酸胍法提取基因组DNA和多重PCR(multiplex PCR)条件的优化,建立了这4种食源性致病微生物的多重PCR检测方法.通过人工污染检测和市场样品检测,同时进行传统方法验证,结果表明:该检测方法简单、快速、准确、灵敏度高,只需经过增菌4～8h其最低检出限可达1cfu/mL,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品卫生检测和临床检验等领域.

金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及其表达特性分析

根据中性海藻糖酶NTL基因的同源序列设计引物,PCR扩增出杀蝗专一菌株———金龟子绿僵菌CQMa102NTL基因片段,利用5′_RACE和3′_RACE扩增出NTLcDNA的5′和3′端序列,经拼接得到CQMa102NTL基因cDNA全长。根据其全长cDNA序列,设计引物PCR扩增出CQMa102NTL的完整基因。为了解该基因的上游调控信息,采用PanhandlePolymeraseChainReactionAmplification方法扩增其上游序列。序列分析表明,CQMa102NTL全长DNA3484bp,cDNA全长2385bp,编码737个氨基酸的蛋白,推测蛋白分子量为83.1kD;含有3个内含子,包含一个依赖于cAMP的磷酸化作用位点(RRGS)和一个钙附着位点(DTDGNMQITIED);上游序列含有一个压力反应元件(CCCCT);与金龟子绿僵菌广谱性菌株ME1NTL的核苷酸序列和氨基酸序列分别具有93%和99%同源性,由此确定该序列为金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因序列。Southern杂交表明,NTL基因在CQMa102基因组中为单拷贝。Northern杂交表明,NTL基因转录出约2.5kb的mRNA单带,在液体培养条件下,对数生长前期表达水平最高,对数生长后期降到最低,进入稳定生长期后表达水平又有所提高。金龟子绿僵菌CQMa102中性海藻糖酶基因DNA全长和cDNA全长登录GenBank,登录号分别为:AY557613,AY557612。

柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体基因的构建及表达产物的生物学活性分析

【目的】构建鼠源抗柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体(dsFv)片段基因,原核表达并将其复性为具有免疫活性的dsFv抗体。【方法】采用PCR定点突变的方法构建dsFv重链(VH)及轻链可变区(VL)基因,分别将其连接入表达载体中,于E.coliBL21(DE3)中诱导表达,表达产物溶解后稀释入复性缓冲液中使其重折叠为dsFv抗体并纯化。SDS-PAGE及Western-blot分析表达及复性产物,BIAcore检测dsFv与Xac-LPS的亲和力,ELISA验证dsFv的特异性及稳定性。【结果】测序结果表明在VH的44位和VL的100位成功引入了半胱氨酸突变位点,实现了高效的原核表达,表达产物主要以包涵体的形式存在。SDS-PAGE分析显示VH和VL的大小为23kD,并将其成功复性,复性后大小为46kD。BIAcore分析表明dsFv对Xac-LPS保持了很高的亲和力,亲和常数(KD)达到3.40×10-10M。ELISA证明dsFv具有较高的抗原特异性并且热稳定性较scFv提高近20℃。【结论】成功表达并复性了dsFv抗体,为柑橘溃疡病菌的免疫诊断提供了高效优质的重组抗体。

天然除虫菊酯检测方法的研究进展

天然除虫菊酯已成为当今无公害生物杀虫剂的研究热点之一,广泛应用于农业、林业、生物农药和食品卫生安全等多个领域。本文总结了目前相关研究的现状与成果,分析了目前应用于检测天然除虫菊酯的薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法及联用技术的优缺点。重点讨论了在天然除虫菊酯残留检测方法中,代表其发展趋势的免疫学方法及生物传感器技术,并在此基础上提出实现检测的设想。

马铃薯病毒病分子检测技术研究进展

快速、准确地定性或定量检测马铃薯植株中病毒、类病毒的种类和数量是有效地控制马铃薯病毒病害的需要 ,也是马铃薯种薯品质的重要保证。

重庆地区致病疫霉交配型测定

通过对峙培养在RSA和RTA上对重庆地区主要马铃薯和番茄产区的致病疫霉交配型进行了测定。结果显示,分离自重庆地区8个县(区)的186个致病疫霉菌株均为A1交配型,没有检测到A2交配型。这一结果表明该地区的致病疫霉仍以A1交配型为主。

绿僵菌孢子活性的MTT比色法快速检测技术研究

通过比较孢子浓度、MTT终浓度、反应温度、反应时间、MTTf提取时间以及pH值等因素对孢子活性检测的影响,优化了MTT比色法杀蝗绿僵菌孢子活性检测条件,建立起稳定、灵敏、可靠的生化检测体系,适用于绿僵菌等真菌农药原药与制剂中活孢率的快速测定,为真菌农药研制提供了新的质量分析方法。

金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因的序列特性分析

目的获得酸性海藻糖酶基因(ATM1)并对其序列进行分析。方法根据已知序列设计引物,PCR扩增出金龟子绿僵菌ATM1的cDNA和DNA序列,对其推导的氨基酸序列基于多序列局部比对和结构的序列比对进行分析。结果ATM1cDNA序列包含开放阅读框(ORF)3219bp,3’端非翻译区(3’UTR)175bp和5’端非翻译区(5’UTR)498bp。结论成功获得ATM1基因,通过序列分析确定出4组保守性功能序列。ATM1基因在CQMal02基因组中为单拷贝。

金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因的克隆及其序列特征分析

根据酸性海藻糖酶的蛋白质序列设计引物,PCR扩增出CQMa102 ATM1的cDNA和DNA序列,登录号分别为:DQ237957,EF190950.序列分析表明,ATM1 DNA序列含有3个内含子,其开放阅读框(ORF)编码1个含1 073个氨基酸的蛋白质,具有1个20个氨基酸的信号肽序列和含有30个可能的N-糖基化位点(Asn-Xaa-Ser/Thr).NCBI序列比对(Blastn)显示该蛋白与Aspergillus fumigatus的alpha、alpha-trehalose glucohydrolase,Aspergillus nidulans的酸性海藻糖酶前体和Talaromyces emrsonii的酸性海藻糖酶分别有62%、59%和57%的氨基酸相似性,与另外两个真菌Saccharomyces cerevisiae(Ath1p)和Candida albi-cans(Atc1p)的酸性海藻糖酶也具有约25%的氨基酸相似性.Southern杂交表明,ATM1基因在CQMa102基因组中为单拷贝.

杀虫真菌与苏云金芽胞杆菌对草地贪夜蛾的联合室内杀虫活性研究

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J. E. Smith)是一种迁飞性重大害虫。为了弄清不同微生物联合使用对草地贪夜蛾的生防潜力,在室内条件下采用直接喷雾方法,测定了金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliaeCQMa421、球孢白僵菌BeauveriabassianaZJU435和苏云金芽胞杆菌(Baci1lusthuringiensis,Bt)G033A两两之间对草地贪夜蛾幼虫的室内联合杀虫活性。结果表明:金龟子绿僵菌CQMa421与球孢白僵菌ZJU435悬浮液联合接种10 d后,1~3龄草地贪夜蛾幼虫校正死亡率分别为65.6%、58.8%和35.4%,都显著高于CQMa421和ZJU435单剂处理组。CQMa421与Bt联合接种5 d后,2龄草地贪夜蛾幼虫校正死亡率为82.6%,显著高于CQMa421(21.1%)和Bt(65.5%)单剂处理;ZJU435与Bt联合接种5 d后,2龄和4龄草地贪夜蛾幼虫校正死亡率为80.4%和68.6%,显著高于Bt和ZJU435单剂处理组。上述试验结果表明:不同杀虫真菌联合使用、杀虫真菌与Bt联合使用能有效提高对草地贪夜蛾幼虫的杀虫活性,为田间利用不同微生物农药有效防控草地贪夜蛾提供了依据。

马铃薯种苗复合感染病毒多重RT-PCR同步快速检测

基于马铃薯病毒ssRNA的快速制备方法,根据马铃薯病毒CP基因序列设计PVX、PVS、PVY和PLRV特异性引物对、P1基因序列设计PVA特异性引物对,建立了多重RT-PCR快速检测体系,可以同步检出复合侵染马铃薯种苗主要病毒,灵敏度比传统的ELISA至少高100倍.结合生物活性稳定剂研制的固相化检测试剂盒,已用于四川和重庆等省区的15个县市田间与苗圃248个马铃薯显症或无症样品的实际检测,表明四川和重庆地区2～3种马铃薯病毒往往复合侵染(PVX、PVA和PVS三种病毒复合侵染或PLRV和PVY二种病毒复合侵染).

反相高效液相色谱分离纯化天然除虫菊酯

天然除虫菊酯含有6种有效成分,但结构相似,分离困难。本研究以除虫菊酯精油为原料,通过优化反相高效液相色谱分离条件,分离纯化了除虫菊酯6种有效成分,纯度均达到99%。然后用气相色谱-质谱定性分析确证6种成分。本研究所建立的天然除虫菊酯6种有效成分的反相高效液相色谱分离纯化方法,为天然除虫菊酯除虫菊酯残留检测提供了准确的判断标准,为阐明天然除虫菊酯6种单一有效成分的杀虫机理研究奠定了基础,也为除虫菊酯6种单一有效成分纯品的生产提供了重要的方法参考。

PCR、DIA与致病性测定法检测柑桔溃疡病菌的比较

依据柑桔溃疡病菌全基因组序列的独有保守区域设计筛选出的特异性引物对JYF5/JYR5,用于柑桔溃疡病菌的PCR检测,具有很好的检测特异性、灵敏度和稳定性。同时比较了PCR与DIA(斑点免疫结合技术)及传统的致病性测定法在检测灵敏度、稳定性及田间样品检出率等方面的差异。结果表明,PCR的检测灵敏度可达103～104cfu·ml-1(每个反应体积约10个细菌),明显高于DIA(104～105cfu·ml-1,每个样点约300个细菌);PCR、DIA和致病性测定法检测田间显症样品的检出率均可达到100%,而检测柑桔无症样品的检出率依次降低。此外,通过排除PCR抑制物质和在PCR反应体系中加入终浓度为15%的甘油,有效地降低了检测中存在的假阴性。

海藻糖的生产制备及其应用前景

海藻糖是一种广泛分布于细菌、真菌和动植物体内的双糖。在生物体内 ,它不仅作为结构成分和能量物质存在 ,而且在热击和脱水等协迫条件下 ,对生物体和生物大分子起着良好的非特异性保护作用。由于其独特的生物学功能 ,它在食品、分子生物学、医药、化妆品、农业等方面具有广阔的应用前景。简述海藻糖的生产制备、应用研究及其前景展望。

3种致病菌多重PCR检测体系的建立及应用

金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogen,LM)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus,BC)是食品中重要的致病菌,建立其多重PCR的快速检测体系,对开发食源性致病微生物快速检测试剂盒具有重要意义。根据SA的nuc基因、LM的hly基因和BC的hemolysin基因,设计合成3对特异性引物,然后进行单基因PCR反应特异性验证。在此基础上建立了3种致病菌的多重PCR检测体系,并应用于食品检测中,同时以国标法进行对比验证。结果表明,建立的多重PCR检测方法简单、快速、灵敏度高,检测灵敏度可达到1 cfu/mL,整个检测时间在16 h以内,具有较大的应用价值,可广泛应用于食品卫生检测以及临床检验等领域。