高糖微环境下P62对人表皮细胞株HaCaT迁移和运动性的影响及其机制

目的研究高糖微环境下P62蛋白对人表皮细胞株HaCaT迁移和运动性的影响及其可能的分子机制,以探讨糖尿病足创面难愈合的机制。方法采用实验研究方法。取对数生长期HaCaT进行实验。取细胞,按随机数字表法(分组方法下同)分为正常对照组(培养液含终物质的量浓度5.5 mmol/L的葡萄糖)及高糖(培养液含终物质的量浓度30.0 mmol/L的葡萄糖)24 h组、高糖48 h组、高糖72 h组。正常对照组细胞行常规培养72 h,高糖72 h组细胞行高糖培养72 h,高糖48 h组细胞先常规培养24 h再高糖培养48 h,高糖24 h组细胞先常规培养48 h再高糖培养24 h后,采用蛋白质印迹法检测P62蛋白表达。取细胞,分为正常对照组、高糖组,分别同前培养48 h后,采用免疫荧光法检测P62蛋白表达(以绿色荧光表示)。取细胞,分为阴性对照小干扰RNA(siRNA)组、P62-siRNA-1组、P62-siRNA-2组、P62-siRNA-3组,并转染相应试剂,于转染后72 h,采用蛋白质印迹法检测P62蛋白表达。取细胞,分为正常糖+阴性对照siRNA组、正常糖+P62-siRNA组、高糖+阴性对照siRNA组、高糖+P62-siRNA组,并行相应处理,于转染后72 h,采用蛋白质印迹法检测P62蛋白表达;行划痕试验检测并计算划痕后24 h细胞迁移率(样本数为9);在活细胞工作站下,观察3 h内细胞运动范围并计算运动速度(正常糖+阴性对照siRNA组、正常糖+P62-siRNA组、高糖+阴性对照siRNA组、高糖+P62-siRNA组观察细胞数分别为76、75、80、79个)。取细胞,分为正常糖+磷酸盐缓冲液(PBS)组、高糖+PBS组、高糖+N-乙酰半胱氨酸(NAC)组,行相应处理后,于培养48 h,分别采用蛋白质印迹法及免疫荧光法检测P62蛋白表达。除划痕试验外,其余实验各组样本数均为3。对数据行单因素方差分析、LSD检验。结果与正常对照组比较,高糖24 h组、高糖48 h组及高糖72 h组细胞P62蛋白表达量均明显增加(P<0.01)。培养48 h,高糖组细胞中P62的绿色荧光强于正常对照组。转染后72 h,与阴性对照siRNA组比较,P62-siRNA-1组、P62-siRNA-2组和P62-siRNA-3组细胞P62蛋白表达量均明显减少(P<0.01)。转染后72 h,与正常糖+阴性对照siRNA组比较,正常糖+P62-siRNA组细胞P62蛋白表达量明显减少(P<0.01),高糖+阴性对照siRNA组细胞P62蛋白表达量明显增加(P<0.01);与高糖+阴性对照siRNA组比较,高糖+P62-siRNA组细胞P62蛋白表达量明显减少(P<0.01)。划痕后24 h,与正常糖+阴性对照siRNA组[(55±7)%]比较,正常糖+P62-siRNA组细胞迁移率明显升高[(72±14)%,P<0.01],高糖+阴性对照siRNA组细胞迁移率明显下降[(37±7)%,P<0.01];与高糖+阴性对照siRNA组比较,高糖+P62-siRNA组细胞迁移率明显升高[(54±10)%,P<0.01]。观察3 h内,高糖+阴性对照siRNA组细胞运动范围较正常糖+阴性对照siRNA组缩小,正常糖+P62-siRNA组细胞运动范围较正常糖+阴性对照siRNA组增大,高糖+P62-siRNA组细胞运动范围较高糖+阴性对照siRNA组增大。与正常糖+阴性对照siRNA组比较,正常糖+P62-siRNA组细胞运动速度明显增加(P<0.01),高糖+阴性对照siRNA组细胞运动速度明显下降(P<0.01);与高糖+阴性对照siRNA组比较,高糖+P62-siRNA组细胞运动速度明显增加(P<0.01)。培养48 h,与正常糖+PBS组比较,高糖+PBS组细胞P62蛋白表达量明显增加(P<0.01);与高糖+PBS组比较,高糖+NAC组细胞P62蛋白表达量明显减少(P<0.01)。培养48 h,高糖+PBS组细胞中P62的绿色荧光强于正常糖+PBS组,而高糖+NAC组细胞中P62的绿色荧光弱于高糖+PBS组。结论在HaCaT中,高糖微环境可促进P62蛋白表达;敲减P62蛋白可促进其迁移并增加运动性;高糖微环境下活性氧增加可能是P62表达增加的潜在机制。