抑癌基因DKK2增强非小细胞肺癌大分割放疗敏感性的研究

目的探讨Dickkopf相关蛋白2(dickkopf2,DKK2)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的表达、甲基化、预后,及与NSCLC大分割放疗敏感性的相关性和潜在作用机制。方法采用qPCR、在线数据库、Kaplan-Meier生存曲线检测DKK2在NSCLC样本的表达、甲基化及预后。以A549细胞为研究对象,通过克隆形成实验、免疫蛋白印迹实验等细胞生物学方法评价DKK2增强NSCLC大分割放疗敏感性的作用。结果DKK2在NSCLC样本的表达显著低于正常肺组织[(0.00042±0.00010)vs(0.00065±0.00020),P<0.001],与分级分期无明显相关性。甲基化数据库分析显示:与正常肺组织相比,DKK2在NSCLC中高甲基化,其甲基化与表达程负相关(P=0.034),DKK2的甲基化程度越高,mRNA表达越低。NSCLC患者大分割放疗敏感性为53.3%;与放疗敏感组相比,DKK2 mRNA表达在放疗抗拒组中明显下调[(0.00064±0.00020)vs(0.00043±0.00020),P<0.001],差异有统计学意义;放疗敏感组的无进展生存期(progression free survival,PFS)优于放疗抗拒组(中位PFS:21.4个月vs 4.6个月)。DKK2过表达后,使用4 Gy X-ray照射能抑制A549细胞增殖;Western blot示过表达DKK2的A549细胞株,4 Gy X-ray照射后DNA损伤标记γ-H2AX明显升高[(1.00±0.24)vs(3.22±0.41),P<0.001],差异有统计学意义。结论DKK2在NSCLC中因甲基化缺失而表达下调,可能是预测NSCLC大分割放疗敏感性的重要靶点。

ZNF407通过TGF-β/Smad信号通路抑制皮肤黑色素瘤迁移与侵袭的影响

目的探讨锌指蛋白ZNF407在黑色素瘤(melanoma)中的表达和功能,及对黑色素瘤迁移与侵袭的影响和作用机制.方法自2015年1月至2021年1月,收集重庆市中医院皮肤科的黑色素瘤临床样本42例和20例正常色素痣组织,以黑色素瘤组织和细胞系为研究对象,通过免疫蛋白印迹实验和实时荧光PCR检测ZNF407在黑色素瘤组织中相对表达,实时荧光PCR检测ZNF407在黑色素瘤细胞系中相对表达;Pearson相关性检测分析ZNF407与TGF-β1在黑色素瘤中的表达相关性;以黑色素瘤细胞系A375细胞为研究对象进行ZNF407基因过表达,分别转染pcDNA3.1(+)-Flag-ZNF407(实验组)和pcDNA3.1(+)-Flag-Vector(对照组),未转染为空白对照组.Transwell实验验证实验组和对照组中A375细胞迁移和侵袭的影响;半定量PCR和实时荧光PCR检测ZNF407对细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关mRNA表达水平的影响,免疫蛋白印迹实验检测ZNF407对EMT相关蛋白表达水平的影响;免疫蛋白印迹实验检测ZNF407对TGF-β信号通路的影响.结果免疫蛋白印迹实验和实时荧光PCR显示:与色素痣细胞组织相比,ZNF407蛋白和mRNA在黑色素瘤组织中表达下调(P<0.001);实时荧光PCR显示:与正常色素痣细胞相比,ZNF407 mRNA在黑色素瘤细胞中表达下调(P<0.001).Transwell迁移实验显示:与对照组相比,实验组穿出小室细胞数(116±17)低于对照组(265±27,P<0.01)和空白对照组细胞(259±28,P<0.01);侵袭实验显示:实验组穿出小室细胞数(82±14)低于对照组(215±31,P<0.01)和空白对照组细胞(209±32,P<0.01).免疫蛋白印迹实验显示:过表达ZNF407后,实验组Vimentin、N-cadherin、Twist和MMP7的蛋白表达下调;E-cadherin的蛋白表达上调(P<0.001);半定量PCR和实时荧光PCR显示:过表达ZNF407后,实验组中干细胞标记物ABCG2、Snail2和OCT4 mRNA表达下调(P<0.001).Pearson相关性分析显示:黑色素瘤组织中ZNF407 mRNA与TGF-β1的表达呈负相关(P=0.033,r=-0.714).免疫蛋白印迹实验显示:与对照组和空白对照组蛋白水平相比,实验组中TGF-β1、p-Smad1、p-Smad2、p-Smad3、p-Smad4和c-Myc蛋白表达水平降低.结论ZNF407蛋白和mRNA在黑色素瘤中表达下调,对ZNF407基因过表达能抑制黑色素瘤细胞系的细胞迁移和侵袭;ZNF407基因过表达后可抑制TGF-β/Smad信号及通路下游靶分子的表达,能作为重要的抑癌基因参与其发生发展.