高毒力杀虫真菌基因工程菌株选育的进展与方向

病原真菌主要通过体壁侵染昆虫,在害虫防治中具有重要作用。利用昆虫病原真菌研制杀虫真菌农药的主要技术难点是选育高毒力杀虫真菌工程菌,本文综述了高毒力杀虫真菌工程菌构建技术的现状和菌株选育的进展,分析了其中存在的问题。根据昆虫病原真菌致病机制、害虫新靶标发现等方面的研究进展,提出了高毒力杀虫真菌工程菌选育技术的发展方向。

杀虫真菌与苏云金芽胞杆菌对草地贪夜蛾的联合室内杀虫活性研究

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J. E. Smith)是一种迁飞性重大害虫。为了弄清不同微生物联合使用对草地贪夜蛾的生防潜力,在室内条件下采用直接喷雾方法,测定了金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliaeCQMa421、球孢白僵菌BeauveriabassianaZJU435和苏云金芽胞杆菌(Baci1lusthuringiensis,Bt)G033A两两之间对草地贪夜蛾幼虫的室内联合杀虫活性。结果表明:金龟子绿僵菌CQMa421与球孢白僵菌ZJU435悬浮液联合接种10 d后,1~3龄草地贪夜蛾幼虫校正死亡率分别为65.6%、58.8%和35.4%,都显著高于CQMa421和ZJU435单剂处理组。CQMa421与Bt联合接种5 d后,2龄草地贪夜蛾幼虫校正死亡率为82.6%,显著高于CQMa421(21.1%)和Bt(65.5%)单剂处理;ZJU435与Bt联合接种5 d后,2龄和4龄草地贪夜蛾幼虫校正死亡率为80.4%和68.6%,显著高于Bt和ZJU435单剂处理组。上述试验结果表明:不同杀虫真菌联合使用、杀虫真菌与Bt联合使用能有效提高对草地贪夜蛾幼虫的杀虫活性,为田间利用不同微生物农药有效防控草地贪夜蛾提供了依据。

昆虫病原真菌致病机制的研究进展

为深入了解昆虫病原真菌的致病机制,为杀虫真菌的基因工程改良、高毒力的生防工程菌株的选育提供理论依据,并为动、植物真菌病害的致病机理研究和控制提供理论参考,从真菌侵染宿主过程中不同阶段的分子生物学行为方面综述了国内外对昆虫病原真菌的致病机制研究的最新进展,探讨了研究中存在的问题,并展望了昆虫病原真菌未来的研究发展趋势。

杀虫真菌对草地贪夜蛾不同虫态的室内活性

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J. E. Smith)是一种联合国粮农组织预警的全球重大害虫。为了评价杀虫真菌对草地贪夜蛾的生防潜力,在室内条件下测定了杀虫真菌金龟子绿僵菌CQMa421、球孢白僵菌ZJU435对草地贪夜蛾不同龄期幼虫、蛹、成虫和卵的杀虫活性以及对卵孵化率、蛹羽化率等影响。结果显示:26℃条件下,菌株CQMa421和ZJU435对草地贪夜蛾低龄幼虫具有杀虫活性,接种10 d后对1龄幼虫的校正死亡率分别为35.6%和50.5%,但随虫龄增大杀虫活性降低,其中菌株CQMa421对4龄幼虫几乎没有杀虫活性;菌株CQMa421和ZJU435都引起草地贪夜蛾蛹黑化,降低其羽化率50%以上;但对成虫没有杀虫活性,也不影响成虫的产卵;卵接种菌株CQMa421和ZJU435后,孵化率分别为82.8%和90.7%,显著低于空白对照的100%,并极大地降低新孵化幼虫的存活率,分别为20.8%和0.0%,而空白对照为79.4%。结果表明,杀虫真菌CQMa421和ZJU435对草地贪夜蛾低龄幼虫、蛹和卵具有杀虫活性,同时降低卵的孵化率、新孵化幼虫存活率和蛹羽化率,对草地贪夜蛾种群控制极具潜力。

昆虫神经毒素BjαIT的表达及杀虫活性

根据毕赤酵母Pichia pastoris密码子偏爱性,不改变毒素蛋白质一级结构,设计合成了昆虫神经毒素BjαIT基因,并分别克隆至大肠杆菌Escherichia coli融合表达载体pPET30-a(+)和毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K。在IPTG的诱导下,神经毒素在大肠杆菌中融合表达,表达产物利用镍亲和层析柱纯化,纯化产物用于制备抗血清和活性测试。采用斑点杂交,筛选得到了较高水平分泌表达重组BjαIT的酵母转化子,摇瓶条件下,毒素表达量最大可达约20mg/L。大肠杆菌BjαIT表达产物对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis和德国小蠊Blattela germanica没有活性,但酵母表达产物经注射东亚飞蝗和德国小蠊表现出杀虫活性。

绿僵菌孢子活性的MTT比色法快速检测技术研究

通过比较孢子浓度、MTT终浓度、反应温度、反应时间、MTTf提取时间以及pH值等因素对孢子活性检测的影响,优化了MTT比色法杀蝗绿僵菌孢子活性检测条件,建立起稳定、灵敏、可靠的生化检测体系,适用于绿僵菌等真菌农药原药与制剂中活孢率的快速测定,为真菌农药研制提供了新的质量分析方法。

杀葱蝇高毒力真菌菌株的筛选

从实验室保存的真菌菌株初步筛选获得6株对葱蝇有一定致病力的白僵菌菌株,通过室内生测进一步测定不同菌株对葱蝇幼虫的毒力。测试结果表明,在相同浓度的孢子悬浮液处理下(1×107孢子/m L),菌株CQBb119的致死率最强,第14 d对葱蝇幼虫的致死率达到77.78%,僵虫率达到58.52%,致死中时(LT50)为6.10 d。使用不同浓度孢子悬浮液处理葱蝇的各个虫态,结果显示,在不同浓度孢子悬浮液处理下,随着孢子悬浮液浓度的增加,葱蝇的死亡率逐渐升高,致死中时降低。在1×108和1×109孢子/m L浓度的菌液处理下,第14 d对葱蝇幼虫的LT50分别为5.48和4.94 d;LC50为1.35×106孢子/m L。菌株CQBb119对葱蝇成虫和蛹也有一定致死作用,但成虫和蛹的死亡率均未能达到50%。结果表明,球孢白僵菌菌株CQBb119对葱蝇幼虫具有良好杀虫活性,可以用于防控葱蝇的潜在生防制剂开发。

昆虫中海藻糖代谢的研究进展

海藻糖是由2个葡萄糖分子组成的非还原性双糖,存在于大量生物如细菌、真菌、植物和昆虫等中。作为昆虫血液中的主要成分,海藻糖是由脂肪体中的海藻糖合成酶和海藻糖磷酸化酶合成的。海藻糖必须被海藻糖分解酶分解成葡萄糖才能用于糖酵解,以提供昆虫能量的需求。脂肪体的海藻糖合成是受激素调控的,而血液中海藻糖的主要来源是脂肪体中的糖原。昆虫的海藻糖分解酶已经得到了很好的研究,但是它的活性控制机制还不清楚。

昆虫病原真菌防控草地贪夜蛾的现状、问题与展望

草地贪夜蛾是世界性重大农业害虫,危害大、防控难。昆虫病原真菌菌种资源丰富,具有易流行、害虫不易产生抗性等突出优点,在草地贪夜蛾防控中应用潜力大。本文综述了昆虫病原真菌在草地贪夜蛾防治中的现状,分析了存在的问题,重点指出了昆虫病原真菌在草地贪夜蛾防治中的发展方向,为进一步发挥昆虫病原真菌在草地贪夜蛾防控中的作用提供参考。

金龟子绿僵菌CQMa421与杀虫剂、杀菌剂的兼容性

本研究通过测试杀虫剂和杀菌剂在田间使用剂量下对金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae CQMa421孢子萌发率的影响,筛选了与菌株CQMa421兼容的25种防治水稻、蔬菜和茶叶重要害虫的常用杀虫剂和11种防治水稻、蔬菜重要病害的杀菌剂。结果表明,农药有效成分、浓度影响绿僵菌CQMa421孢子萌发率外,制剂组成也是重要影响因素,不同厂家的同一有效成分的杀虫剂对菌株CQMa421活性影响存在差异,研究结果为活体微生物农药与其他杀虫剂、杀菌剂的联合使用提供了依据。

昆虫神经毒素LqhIT2的表达、抗血清制备及活性分析

根据毕赤酵母密码子偏爱性,不改变毒素蛋白质一级结构,设计合成了昆虫神经毒素LqhIT2基因,并分别克隆至大肠杆菌融合表达载体pPET30-a(+)和毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K。在IPTG的诱导下,神经毒素在大肠杆菌中融合表达,表达产物经镍亲和层析纯化后,用于免疫BALB/c小鼠,制备了特异性较高的抗血清,抗体滴度超过1:128 000。利用制备的抗血清,采用斑点杂交,筛选得到了较高水平分泌表达重组LqhIT2的酵母转化子,摇摇摇摇下,毒素表达量约9 mg/L。大肠杆菌表达产物没有生物活性,酵母表达产物经注射蝗虫表现出杀虫活性。

除虫菊酯人工抗原的合成及鉴定

通过在除虫菊酯6种单体的五元环酮基上引入羧基的方法制备半抗原,再用碳二亚胺法偶联到牛血清白蛋白(BSA)上制得完全抗原。经紫外光谱测定,6种完全抗原的分子偶联比为6∶1(除虫菊酯Ⅰ:BSA)、13∶1(除虫菊酯II:BSA)、9∶1(瓜叶菊酯Ⅰ:BSA)、11∶1(瓜叶菊酯II:BSA)、7∶1(茉酮菊酯Ⅰ:BSA)和9∶1(茉酮菊酯II:BSA)。以完全抗原免疫BALB/c小鼠制抗血清,采用间接酶联检测抗体效价均达到105以上,再用饱和硫酸铵沉淀得到除虫菊酯的多克隆抗体。该结果为除虫菊酯的酶联抗体检测及免疫分析技术奠定了基础。

金龟子绿僵菌CQMa421对棉蚜、绿盲蝽的田间防效

棉花是我国重要的经济作物,虫害严重制约了棉花生产,造成棉农的经济损失。目前,化学杀虫剂仍是防治棉花虫害的主要手段,长期使用化学杀虫剂导致棉蚜Aphis gossypii、绿盲蝽Apolygus lucorum产生抗药性,降低防治效果。本研究使用80亿孢子/mL金龟子绿僵菌CQMa421可分散油悬浮剂防治棉蚜、绿盲蝽,室内生测结果表明,金龟子绿僵菌CQMa421能有效侵染棉蚜和绿盲蝽,随着浓度的升高,对棉蚜和绿盲蝽的毒力增强。田间试验结果表明,该药剂能有效控制棉花主要害虫棉蚜和绿盲蝽。采用1200 mL/hm 2用量,药后14 d对棉蚜的防效达94.42%;采用1350 mL/hm 2用量,药后14 d对绿盲蝽的防效分别达到87.25%(新疆),91.62%(湖北)。

两株绿僵菌菌株的分离鉴定及其对花生蛴螬的致病力

从山东日照、青岛两地的花生生产示范大田采集得到天然罹病的花生蛴螬僵虫中,分离得到两株绿僵菌菌株(Metarhizium spp.)。对两株菌株的ITS1-5.8S rRNA-ITS2区域进行序列分析,并结合菌株的形态和培养特征,分别确定为平沙绿僵菌M.pingshaense(CQM132)和贵州绿僵菌M.guizhouense(CQM135)。筛选了菌株CQM132和CQM135的最适培养温度和最适培养基,结果表明两个菌株均在28℃温度条件下,在PPDA培养基上的生长速度最快且产孢时间显著最短。室内测定了菌株CQM132和CQM135对铜绿丽金龟和暗黑腮金龟幼虫(蛴螬)的致病力。结果表明,菌株CQM132和CQM135对铜绿丽金龟和暗黑腮金龟幼虫均具有较强的毒力。菌株CQM132的高浓度孢悬液(1.1×107～1.1×108孢子mL-1)对两种金龟幼虫的累计死亡率均达到85%以上,致死中时LT50≤7.58 d。菌株CQM135的高浓度孢悬液(1.1×107～1.1×108孢子mL-1)对两种蛴螬的累计死亡率均达到90%以上,致死中时LT50≤6.85 d。相比而言,菌株CQM135对两种蛴螬的致病力略优于菌株CQM132,可以作为优良菌株进一步研究。

莱氏野村菌CQNr01微菌核的人工诱导培养

【目的】诱导莱氏野村菌的微菌核形成,为该菌靶标害虫的生物防治提供新的制剂类型和生产工艺。【方法】采用包含特定盐离子成分的液体培养基进行诱导培养,并对培养基中的碳﹑氮源浓度及碳氮比例进行优化;将微菌核干燥保存后复水测定菌核萌发率及对斜纹夜蛾幼虫的致病力。【结果】优化筛选出莱氏野村菌CQNr01微菌核诱导培养基,成功诱导莱氏野村菌菌株CQNr01产生细胞结构分化、色素沉着的微菌核结构;微菌核的产生数量受培养基中碳和氮素含量和相对比例的影响,在一定范围内,同样碳氮比情况下,低碳培养液有利于微菌核的产生。微菌核耐干燥保存,掺加硅藻土制备的微菌核制剂经干燥处理并贮存6个月吸水后仍能萌发产孢。微菌核制剂对斜纹夜蛾幼虫具有侵染活性,接种14 d后,供试昆虫的校正死亡率可达78.56%,供试浓度下,LT50约为7 d。【结论】莱氏野村菌的微菌核受特定培养基成分的诱导,获得的微菌核耐干燥且对寄主害虫具有很高的致死率,可以作为该菌生防制剂开发应用。

优化重叠PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变

利用重叠PCR技术扩增单链抗体基因或位点突变是抗体文库构建或稳定表达的关键和难点，国内外文献未见其方法学的系统报道。以不同VH、VL和Linker基因为拼接模板进行重叠PCR，针对影响重叠PCR扩增的拼接类型，引物设计，反应条件等进行优化。结果表明两段重叠连接比三段更容易实现，且扩增效果好；引物的互补序列长度一般应大于15bp，且在18—24bp时扩增效果最好；退火温度在52—600C，Mg^2＋浓度在1．5—2．5mM时对拼接的效果影响较小；直接或间接使用拼接模板均可以实现重叠PCR的扩增。利用优化策略，首次构建了抗除虫菊酯的scFv基因文库并引入抗XAC糖蛋白scFv基因的点突变，为除虫菊酯抗体文库构建和抗XAC重组抗体的稳定表达奠定了基础。

绿僵菌与高效氯氰菊酯复配对东亚飞蝗的增效作用

本研究测定了金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae与高效氯氰菊酯高纯度原药复配后对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis （Mey.）的增效作用。含0.5%~1.5%（w/v）高效氯氰菊酯的绿僵菌复配制剂的共毒系数（CTC）都高于120,其中复配制剂（1%高氯.1×1010孢子/ml绿僵菌油悬浮剂）的共毒系数在接种后第4、5d分别为268.92和375.93。该复配制剂按1∶2、1∶3比例稀释后室内喷雾接种,第5d蝗虫累计死亡率分别达97.8%和97.3%,显著高于绿僵菌对照组的累计死亡率（52.6%）;田间施药后蝗虫存活率在第6d分别下降到2.4%和4.4%,显著低于绿僵菌对照组药后第9d的存活率（37.7%）。结果表明：绿僵菌复配制剂增效作用明显,作用较快、防效高,克服了绿僵菌悬浮剂难以用于高密度蝗虫防治的缺陷。

莱氏野村菌微菌核一步液体发酵新工艺

莱氏野村菌微菌核已成功实现了液体诱导培养和对其分子发育机理的研究。为实现微菌核的规模化生产,我们通过对不同类型的接种体、不同培养时间的接种体和不同接种量对莱氏野村菌微菌核产量和生物量进行了研究。结果显示,培养24-48 h的菌体能够作为液体一步发酵的有效接种体,微菌核产量均达到1.0×10^4微菌核/mL。并优化莱氏野村菌微菌核液体30 L发酵工艺,产率达到20%-30%。研究结果为莱氏野村菌微菌核的规模化生产提供了科学数据参考。

金龟子绿僵菌CQMa421杀蟑饵剂药效测定与现场应用研究

目的测试金龟子绿僵菌CQMa421饵剂室内和现场防治德国小蠊效果,为真菌杀虫剂在防治卫生害虫上的应用提供参考。方法配制不同含量的金龟子绿僵菌CQMa421饵剂,分别在实验室和现场环境研究其对德国小蠊种群数量的影响,采用SPSS 25.0软件对死亡率、半数致死时间(LT_(50))、半数致死浓度(LC50)和90%致死浓度(LC90)进行分析,评价金龟子绿僵菌CQMa421饵剂杀蟑效果;采用χ^(2)检验分析不同组别间死亡率的差异。结果室内实验结果表明,1×10^(8)孢子/g金龟子绿僵菌CQMa421饵剂喂食德国小蠊后12 d,其LT_(50)均值为(6.85±0.24)d;现场实验中,采用每2.5 m^(2)放置1盒1×10^(8)孢子/g的金龟子绿僵菌CQMa421饵剂,药剂投放30 d后,相对密度下降率为93.22%。结论 1×10^(8)孢子/g的金龟子绿僵菌CQMa421饵剂可有效控制德国小蠊种群密度。

BjαIT的表达、抗血清制备及scFv基因库的构建

根据成熟昆虫神经毒素BjαIT的氨基酸序列,人工合成毒素基因,并克隆至大肠杆菌表达载体pPET-30a(+)。在IPTG的诱导下,神经毒素在大肠杆菌中融合表达,表达产物经镍亲和层析纯化,纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备了特异性较高的抗血清,抗体滴度达1:512,000。提取免疫小鼠脾细胞总RNA,通过RT-PCR分别扩增重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因片段,在连接肽linker的连接下成功构建了包含抗BjαIT的全长scFv基因库。本研究为新型蝎昆虫神经毒素BjαIT的检测奠定了基础。