生物技术制药实验教学模式的探索

生物技术制药是一门实践性和综合性很强的学科，是当前研究最热、发展迅速的学科之一。随着科学技术的迅猛发展．生物制药已成为最活跃、发展最快的产业之一。制药业对生物技术制药人才的需求也日益增加．针对这些情况．如何增强生物技术制药实验课的教学效果，培养高素质的具有创新精神和实践能力的生物技术制药人才，是当前培养生物技术专业人才所需要重点关注的问题之一。生物技术制药课程着重讨论应用基因工程、发酵工程、酶工程、细胞工程、抗体工程、蛋白质工程等现代生物技术的原理和方法研制生物制品，是“现代生物技术”与“制药”的有机结合。因此，本课程涉及的知识面广，内容多，不仅包括与生物技术相关的一些基本理论．还包括与制剂、质量控制等生物制药相关药学知识。

重庆市及三峡库区家畜中大肠杆菌O157带菌的流行病学调查

采集重庆市及三峡库区6个区县家畜粪便样品1 473份,接种mEC+n增菌肉汤37℃振摇孵育6 h,取增菌液接种CT-SMAC平板,37℃培养18 h,挑取可疑菌落,经血清学检验、PCR扩增和微量生化实验确认,最后用药敏试纸测试其对常用抗生素的敏感性。结果表明,在1 473份粪便样品中共检出11株O157,其中7株O157:H7,4株O157:H?;对分离菌株做药物敏感性试验,发现它们对青霉素、氨苄西林、杆菌肽、头孢呋肟、红霉素、庆大霉素、四环素等存在不同程度的耐药。这次调查为重庆市及三峡库区该病的预防提供了依据。

肠出血性大肠杆菌O157:H7的分子生物学检测方法研究进展

肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种新型人类病原菌,由它引起的感染严重威胁着人类健康和生命。对其进行分子流行病学调查,可为该病的预防、诊断和治疗提供有力的依据和参考。现就目前常用的几种大肠杆菌O157:H7的分子生物学检测技术作一简介。

生物技术专业实习学员带教体会

生物技术专业实习是学员把课堂上所学的理论知识应用到生物技术实践中，进入到理论与实践相结合的阶段．是整个专业在毕业前最重要的教学环节。这一时期，建立有效的实习带教模式，对实习学员在较短的实习期间增强生物技术操作技能，具备运用理论知识分析问题、解决问题和独立工作的能力，成为德才兼备的生物技术人才是至关重要的。多年来，本科室先后承担了不同层次的生物技术专业实习生带教任务，在此过程中我们进行了一些积极的带教模式的尝试。现将在生物技术实习带教过程中的一些经验体会总结如下：

幽门螺杆菌表位疫苗的设计、构建、表达及其免疫原性研究

目的设计幽门螺杆菌(Hp)的表位疫苗并对其免疫原性进行研究。方法将Hp的尿素酶B亚单位的三个Th表位及一个B细胞表位串联,表位之间用两个赖氨酸(KK)间隔,合成全基因,克隆到pET22b载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;表达的重组蛋白经鉴定纯化后皮下免疫Balbc小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果克隆表达的重组表位疫苗蛋白纯化后纯度达到95%,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,Th表位多肽(U546-561、U229-244、U237-251)、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖(SI>2),并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论本研究中表位疫苗的设计方法能够使疫苗中包含的四个表位均发挥功能,并且具有较强的免疫原性,为研究Hp预防性和治疗性疫苗提供实验基础。

幽门螺杆菌双亚单位表位疫苗的构建及免疫原性研究

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)黏附素(HpaA)和尿素酶B亚单位(UreB)双亚基多表位疫苗,并对其免疫原性进行研究。方法设计引物采用PCR法将黏附素(HpaA)的一个B细胞表位与尿素酶B亚单位的三个TH表位及一个B细胞表位串联起来(HUepi),表位之间用两个赖氨酸(KK)间隔,T-A克隆后构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-HUepi,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白采用阳离子和疏水层析进行纯化,经鉴定后皮下免疫BALB/c小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果PCR法扩增出了约233bp的目的片段;原核表达质粒pET-22b(+)-HUepi经酶切及测序鉴定,目的基因序列与设计序列一致;重组蛋白HUepi表达率约20.0%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约8.38×103Dr,破菌后电泳证实目的蛋白以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度大于97.6%,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,TH表位多肽、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖(SI>2),并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论Hp HpaA、UreB双亚基表位疫苗HUepi经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫原性。为新一代Hp疫苗的研制奠定实验基础。

外源性Wnt5a激活K562细胞非经典Wnt5a／Ca^2＋信号途径研究

目的观察外源性Wat5a对K562细胞非经典Wnt5a/Ca2+途径的影响,进一步研究外源性Wnt5a诱导K562细胞的分化机制。方法激光共聚焦显微镜观察Ca2+内流的变化,以RT-PCR及免疫组化检测β-catenin的表达变化,以Western blot检测cyclinD1的表达变化。结果外源性Wnt5a能明显促进K562细胞Ca2+内流,显著下调cyclinD1表达,且能下调K562细胞β-catenin表达,但β-catenin表达下调无统计学意义。结论外源性Wnt5a能激活K562细胞非经典Wnt5a/Ca2+途径,外源性Wnt5a诱导K562细胞分化机制可能与此相关。

幽门螺杆菌UreB单克隆抗体的制备及尿素酶活性抑制能力的研究

目的制备抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)单克隆抗体,并检测其对尿素酶活性的抑制能力。方法以重组UreB蛋白为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗UreB单克隆抗体,用ELISA检测mAb的效价、亲和常数;用Westernblot检测mAb的特异性。将尿素酶与单克隆抗体预孵育后加入含有尿素和酚红的缓冲液,于550nm测定单克隆抗体对尿素酶活性的抑制能力。结果得到5株稳定分泌抗UreB的单克隆抗体的杂交瘤细胞1D5、9E1、3A2、1D6、6E6。测定抗体亚型1D5,9E1,3A2为IgG1,1D6、6E6为IgG2a,亲和常数分别为4×108、4.6×108、2.8×108、2×109、3×109L/mol。Westernblot鉴定5种单克隆抗体均能和重组UreB及全菌蛋白中的UreB抗原发生特异性结合,且均不与肠道常见菌发生交叉反应。5株单克隆抗体中只有6E6具有对尿素酶活性的抑制作用,且抑制率与单克隆抗体剂量相关。结论制备了5株稳定分泌抗UreB抗体的杂交瘤细胞株,产生的单克隆抗体效价高且特异性好,其中6E6能抑制尿素酶活性。本研究为探讨尿素酶的作用机制、UreB的纯化及Hp的临床诊断和治疗奠定了基础。

微小RNA在免疫调节中的作用研究进展

微小RNA(miRNA)是一类新发现的内源性非编码RNA分子,能在转录后水平调控基因的表达。研究证实,miRNA在细胞增殖、发育、分化、凋亡、代谢、信号转导以及肿瘤发生中发挥重要的调节作用。近年来,一系列的miRNA已被证实参与了免疫反应调控,如固有性免疫应答,T、B淋巴细胞的分化,病原体感染与免疫及炎症的免疫调控等。文中就miRNA在固有性与获得性免疫应答中的调控作用作一综述。

幽门螺杆菌对天然植物成分诱导耐药反应的实验研究

目的探讨幽门螺杆菌(HP)是否会对乳香胶、大蒜油和黄连提取物产生耐药。方法采用多步诱导法进行HP的体外耐药试验,另选临床耐药率很高的甲硝唑和目前抗HP疗效好的克拉霉素作同步试验;观察在药物浓度逐渐增加的培养基上转种的HP最低抑菌浓度(MIC)的变化,将敏感性下降的诱导株在无药培养基上转种3次后检测MIC值,测定乳香胶、大蒜油和黄连提取物对甲硝唑敏感性下降诱导株的MIC值。结果在多步诱导培养过程中,未诱导出对乳香胶、大蒜油和黄连提取物耐药的HP菌株,而在含64倍MIC甲硝唑的培养基上菌株仍能生长。在培养过程中,菌株对甲硝唑的敏感性逐渐下降,MIC值逐渐升高至64μg/mL;甲硝唑耐药株(MR)在无药培养基上转种10次后得到的MR'的MIC值不变。乳香胶、大蒜油和黄连提取物对MR的MIC没有影响。结论HP对乳香胶、大蒜油和黄连提取物不易产生耐药性,且甲硝唑耐药株对三者仍保持敏感。乳香胶、大蒜油和黄连提取物是有良好开发前景的抗HP感染的天然药物。

壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球疫苗制备工艺研究

目的改变壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球制备中的各项参数,最终确认微球制备工艺。方法根据形成乳液的溶解性、流动性及黏稠度,选择微球制备过程中海藻酸钠(AGS)浓度及植物油与海藻酸钠的配比,通过比较形成微球的粒径大小,最终确定微球制备中CaCl2溶液的滴定程序及搅拌速率、搅拌时间等实验参数。结果确定了AGS乳液浓度为2%、植物油与AGS乳液配比为2∶8、CaCl2溶液反滴滴定法等MS制备工艺,并确定了搅拌速率800r/min、药物浓度2mg/ml、制备温度25℃、搅拌时间30min等参数。结论依照上述参数可以制备出符合实验要求的微球疫苗。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位功能片段的纯化及活性研究

目的建立一种有效的尿素酶功能片段的纯化方法。方法应用已构建的尿素酶B功能片段表达载体,IPTG诱导表达,包涵体鉴定试验判断目的蛋白表达形式,AKTA100上分别采用亲和层析和离子层析等多级纯化方式优化纯化条件,HPLC检测纯化蛋白纯度,尿素酶活性阻断试验对纯化后功能片段进行活性鉴定。结果IPTG诱导后目的蛋白高表达,包涵体鉴定试验证实目的蛋白以可溶形式存在宿主细胞中,优化后方案得到目的蛋白纯度>90%且能被尿素酶B免疫的兔血清识别,纯化后蛋白免疫家兔后产生兔抗血清能够特异性中和Hp尿素酶活性。结论成功建立了尿素酶功能片段的纯化方法。

幽门螺杆菌双亚单位基因疫苗的构建及免疫原性研究

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)两个保护性亚单位UreB、HspA融合基因疫苗并观察其免疫原性。方法:从Hp基因组分别扩增出UreB、HspA基因片段,采用重叠延伸PCR方法将两个基因片段构建融合基因,以BglⅡ和XhoⅠ酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经测序确认后转染COS-7细胞,Western blot检测目的蛋白表达,胫前肌注射免疫小鼠后收集血清检测特异性抗体效价。结果:经测序后证实成功将融合基因构建到真核表达载体中,免疫印记检测到目的蛋白表达,并具有良好的抗原性,免疫小鼠后能够产生特异性抗体。结论:成功构建Hp双价DNA疫苗,免疫小鼠后显示出良好的免疫原性,为Hp进一步基因疫苗的研究奠定了基础。

蛋白质抗原表位研究进展

本文综述了蛋白质抗原表位的种类及特性,回顾了近几年来实验确定和理论预测B细胞蛋白质抗原表位的常用方法,介绍了表位作图和表位疫苗的研究现状。

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白分子内佐剂融合疫苗的构建、纯化及活性研究

目的构建幽门螺杆菌(HP)中性粒细胞激活蛋白基因(napA)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(heat-labileenterotoxinBsubunit,LTB)的分子内佐剂融合蛋白疫苗,并通过口服免疫小鼠研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础。方法利用分子克隆技术构建携带napA-LTB融合基因的重组原核表达质粒pET-22b-napA-LTB,转化E.coliBL21(DE3),进行原核表达,重组表达蛋白采用亲和层析柱ChelatingSepharose进行纯化,Tris-Tricine电泳和Westernblot鉴定,GM1-ELISA检测rNAP-LTB与神经节苷脂的结合。口服免疫BALB/c小鼠,检测重组融合蛋白的抗原性。结果重叠延伸PCR扩增出了约760bp的napA-LTB融合基因,其核苷酸序列与GenBank公布的相关序列一致。重组融合蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,表达量约占细菌总蛋白的30%,Tris-Tricine初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约29000,纯化后纯度大于90%。Westernblot检测其具有良好的抗原性。该重组蛋白保持了与GM1神经节苷脂结合的生物学活性。动物实验表明,分子内佐剂疫苗口服免疫小鼠后血清特异性IgG,IgA和胃黏液、肠黏液的抗原特异性sIgA抗体显著高于无佐剂单一亚单位疫苗。结论所获得的重组融合蛋白具有良好的抗原性和黏膜佐剂活性,为进一步的疫苗研究奠定了基础。

重组人IL-10融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10融合蛋白,获得有生物学活性的IL10。方法限制性内切酶NcoⅠ和BamHⅠ双酶切目的基因IL10,插入到同样双酶切的表达载体pET32a,构建重组载体IL10pET32a,测序正确后转化E.coliBL21(DE3),不同温度、低浓度IPTG诱导工程菌表达目的蛋白,SDSPAGE和Westernblot检测目的蛋白的表达,ELISA和MC9细胞增殖法分别测定IL10的含量及生物学活性。结果构建的表达重组载体IL10pET32a经酶切鉴定和序列测定表明完全正确,诱导工程菌可以表达可溶性的融合蛋白IL10Trx,同时也存在包含体融合蛋白,经Westernblot鉴定存在有目的蛋白IL10,MC9细胞增殖法测定可溶性的融合蛋白具有生物学活性。结论成功表达了具有生物学活性的融合蛋白IL10Trx,有助于下游纯化和制备hIL10基因工程药物。

单纯疱疹病毒1型特异性表位的串联表达及免疫性质的研究

目的:串联重组表达单纯疱疹病毒1型(HSV-1)特异性表位,以获得具有抗原反应性能用于HSV-1鉴别诊断的抗原。方法:采用DNA重组技术将HSV-1特异性表位gG112-127进行串联,获得不同倍数重复串联的基因片段。将含有不同重复倍数的基因片段与表达载体连接,转化至宿主细胞JM109,异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷诱导,SDS-PAGE分析其表达,W estern印迹分析其抗原反应性。结果:获得了4×、8×、16×、32×重复串联的阳性重组子。其中8×重组子在JM109细菌中得到了17.5%的表达,其表达产物主要以包涵体形式存在。W estern印迹显示此重组蛋白能与HSV-1抗血清发生抗原抗体反应,而不与HSV-2抗血清发生抗原抗体反应。结论:HSV-1-gG112-127重组蛋白可作为HSV-1特异性检测的抗原来鉴别诊断HSV-1和HSV-2的感染。

小鼠骨髓树突状细胞的体外诱导培养及生物学特性分析

目的探讨从小鼠骨髓中体外诱导培养树突状细胞(DC)的可行性并进行生物学特性分析与鉴定。方法用重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)体外诱导小鼠骨髓细胞分化为树突状细胞,倒置显微镜动态观察形态学变化,扫描电镜观察其表面形态特征,流式细胞术分析细胞表面分子,同时进行抗原吞噬功能和刺激初始型T淋巴细胞增殖能力的检测。结果经体外诱导培养可获得大量未成熟和成熟DC,出现典型树突状形态。未成熟DC的细胞表型为CD11chigh、MHCⅡlow、CD86low,具有极强的抗原吞噬能力;未成熟DC经LPS刺激培养后可转变为成熟DC,细胞表型为CD11chigh、MHCⅡhigh、CD86high,可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。结论体外诱导培养可获得小鼠骨髓来源的未成熟和成熟DC。