人MIF基因启动子多态性与结核病易感性的关系

为了研究巨噬细胞移动抑制因子(MIF)与结核病易感性的关系,分析了肺结核病人和正常人MIF基因启动子多态性。DNA测序分析的结果显示,正常人MIF基因启动子-794区CATT序列重复次数存在明显的差异,5、6和7个拷贝的几率分别是22.2%、44.4%和33.3%。7个肺结核病人中6人有6个拷贝,1人有7个拷贝,出现的频率分别为85.6%和14.3%。对比分析提示,肺结核病人MIF基因启动子区CATT低拷贝数(低于或等于6个)出现的频率明显高于正常人(85.6%比66.6%),可能同结核病的致病相关。

痰中耐药结核分枝杆菌katG基因的快速检测及异烟肼耐药机制研究

目的快速检测痰中耐药结核分枝杆菌katG基因及了解耐异烟肼的分子机制。方法用PCR方法直接从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增katG基因片段,对扩增获得的katG基因片段进行序列测定,比较分析耐多药、全耐、多耐药但对异烟肼敏感、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异。结果于6 h内从耐药肺结核痰中快速检测到katG基因。从临床分离菌株中随机扩增药敏试验证实的耐多药3株,全耐、包括对异烟肼耐药的多耐、对异烟肼敏感的多耐药、全敏感及H37Rv标准结核分枝杆菌株各1株,均扩增获得273bp片段,序列测定比较发现,2株耐多药菌、1株全耐菌及包括异烟肼耐药的多耐药菌株均检测有katG基因点突变,突变位点均为第2066位碱基C突变为G,1例MDR-TB、全敏感株、对异烟肼敏感的多耐药菌株和标准株均无基因突变。结论PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌katG基因及其突变,结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性与katG基因点突变有关,但可能还存在其它值得探讨的机制。

痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因的快速检测及利福平耐药机制研究

目的快速检测痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因,了解利福平耐药的分子机制。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物,用PCR方法从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增rpoB基因片段,对扩增获得的rpoB基因片段进行序列测定,比较分析耐多药、全耐、单耐利福平、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异。结果于6 h内从耐药肺结核痰中快速检测到rpoB基因。耐多药菌株、全耐及单耐利福平分离菌株均检测有rpoB基因点突变,突变位点主要为531、516或526常见密码子,且绝大多数为单碱基突变,发现1例MDR-TB出现479位和531位密码子同时突变。敏感株和标准株无基因突变。结论PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌rpoB基因及其突变,结核分枝杆菌对利福平的耐药性与rpoB基因点突变有关。

结核分枝杆菌H_(37)Rv株Rv0341编码基因iniB的克隆与表达

目的克隆并表达编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因。方法利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增iniB基因,克隆于pET-22b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性。结果克隆并表达了iniB基因,表达的蛋白相对分子质量约43000,诱导2h表达量较高,约为25%。目的蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化后蛋白纯度可达98%以上。经Western blot检测,纯化蛋白与依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)肺结核患者血清呈现强阳性反应,而与非依R菌肺结核患者血清不反应。结论已成功克隆并表达了编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因,表达的重组蛋白具有反应原性及特异性,为依R菌结核病临床血清学快速诊断方法的建立及试剂盒的研发奠定了基础。

结核分枝杆菌Rv0341蛋白编码基因iniB的多态性分析

目的研究结核分枝杆菌假设蛋白Rv0341编码基因iniB的多态性,确认其保守性,分析依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)在利福平(R)培养管中Rv0341高表达的可能原因。方法用大肠埃希菌做为阴性对照,提取依R菌(14株)、耐R菌(23株)、R敏感的结核分枝杆菌(12株)、结核分枝杆菌标准株H37Rv及BCG(共51株)的细菌基因组DNA,利用PCR自基因组DNA中扩增iniB基因,通过ApaⅠ/EcoRⅤ、KpnⅠ/SmaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳检测其带型,对iniB基因进行限制性片段长度多态性分析并测序。结果实验组中iniB基因的酶切图谱完全相同,测序结果亦证实iniB基因无突变。结论 iniB基因在对R依赖、耐药和敏感等不同类型的结核分枝杆菌中是相对保守的;依R菌在Rv0341蛋白表达方面的差异可能是RNA转录差异或利福平诱导的结果。

依赖利福平结核分枝杆菌相关蛋白的氨基酸及其编码基因序列研究

目的研究临床依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)相关蛋白的氨基酸及其编码基因序列。方法以罗氏绝对浓度法药敏实验鉴定临床依R菌株(49株)、耐R菌株(54株)和R敏感菌株(30株),用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDSPAGE)法对不同临床菌株及H37Rv标准株共计134株菌株的菌体蛋白质图谱进行比较分析,通过QTOF2型毛细管液相色谱电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪(LCESIMSMS)对其差异表达蛋白的氨基酸序列进行鉴定,并用对其蛋白的编码基因进行DNA序列分析。结果不同菌株的SDSPAGE菌体蛋白图谱基本相似。49株依R菌有41株(84%)在含R管中的菌体蛋白图谱有一条相同的高表达蛋白带(相对于标准物分子质量43000的下端),约占总菌体蛋白的30%～50%,H37Rv标准株、28株R敏感菌(28/30)及44株耐R菌(44/54)的含R管和对照管的蛋白图谱相似,且无相应的高表达现象;该高表达蛋白经氨基酸序列鉴定为结核分枝杆菌H37Rv假设蛋白Rv0341,相对分子质量为43894,等电点(PI)5.25,得分183。不同菌株的Rv0341编码基因1440bp扩增片段,经DNA测序分析均未发现突变。结论利福平对Rv0341在依R菌中的表达有上调作用,Rv0341与依R菌相关,可视为依R菌的相关蛋白或标志物;Rv0341与依R菌的毒力及细胞壁的合成是否相关有进一步的研究价值。

依赖利福平结核分枝杆菌Rv0341天然蛋白的诊断价值

目的探讨依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)Rv0341天然蛋白检测血清Rv0341抗体,诊断依R菌感染肺结核病的价值。方法典型依R菌经SDS-PAGE、转膜后,获得Rv0341天然蛋白带,采用结核分枝杆菌抗体DIGFA诊断试剂检测血清Rv0341抗体,并考察该方法的重复性、特异性及敏感性。结果利用Rv0341天然蛋白检测血清Rv0341抗体,具有良好的批内和批间重复性;血清Rv0341抗体在耐R菌肺结核组和R敏感菌肺结核组的特异性分别为92.3%(24/26)和79.3%(23/29),在依R菌肺结核R治疗组中的敏感性为88.9%(16/18);在培养阴性结核组中,阳性率为23.8%(29/122)。54份阳性结果血清进行重复实验,确认为阳性。结论Rv0341天然蛋白可作为诊断抗原用于依R菌结核病血清学诊断试剂盒的研发,以快速辅助诊断依R菌结核病,特别对菌阴依R菌结核病更有诊断价值。

耐多药结核分枝杆菌基因突变分析

目的对临床分离的耐多药结核分枝杆菌株进行基因突变分析。方法对耐多药结核分枝杆菌临床分离菌株进行耐药基因的PCR检测,利用基因序列测定方法分析耐药基因突变情况。结果从耐多药结核病(MDR-TB)患者临床分离菌株中快速检测到rpoB、katG、rpsL、embB基因及其突变。耐多药菌株、全耐及单耐利福平分离菌株均检测rpoB基因点突变,突变位点主要为第516、526和531常见密码子,1例MDR-TB出现第479位和第531位密码子同时突变。耐多药菌、全耐菌及单耐异烟肼的菌株均检测有katG基因点突变,突变位点均为第2066位碱基C突变为G。全耐菌和对乙胺丁醇(EMB)耐药的耐多药菌株均检测有embB基因点突变,突变位点均为第306位密码子ATG突变为ACG。全耐菌和对链霉素(SM)耐药的MDR-TB菌株均检测有rpsL基因点突变,突变密码子为CCT突变为CTT,其中从1株对SM敏感的MDR-TB中也检测到突变。全敏感株、标准株及利福平(RIF)、异烟肼(INH)或EMB敏感的耐药株均无rpoB、katG或embB基因突变。结论PCR及基因序列测定可快速检测耐多药结核基因,结核分枝杆菌耐多药性与多个基因突变相关。

依赖利福平结核菌肺结核一例分析

研究发现，有的分枝杆菌在含利福平的培养基中生长旺盛，无利福平反而生长不良，于是将此类结核杆菌称为依赖利福平分枝杆菌（依R菌）。临床上，如果结核病患者体内出现依R菌，再使用利福平，不仅对治疗无反应，而且可使病情加重，预后不佳，但目前临床医师对依R菌普遍认识不足，现将临床1例确诊的依R菌患者报道如下。