Luffin-β-KDEL-uPAcs融合毒素的构建及其抗胃癌SGC-7901细胞的活性研究

目的构建含尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,uPA)裂解位点(uPAcs)和KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)驻留信号序列的丝瓜毒素(Luffin-β)基因的原核载体,表达并纯化其融合毒素蛋白Luffin-β-KDEL-uPAcs(LKP),并探讨融合毒素蛋白LKP抗胃癌SGC-7901细胞的活性。方法 RT-PCR两步法克隆Luffin-β基因,引物延伸法构建Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因并亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,诱导其表达融合蛋白Trx-EK-Luffin-β-KDEL-uPAcs(TELKP)并纯化TELKP,肠激酶(enterokinase,EK)切割TELKP后,纯化与回收目的毒素蛋白LKP,SDS-PAGE对LKP蛋白予以检测鉴定,高效液相色谱法(HPLC)对其进行纯度检测。采用cell counting kit-8(CCK-8)、RT-PCR、West-ern blot等方法,体外检测毒素蛋白LKP经uPA酶裂解后释放Luffin-β的抗胃癌SGC-7901细胞的活性。结果成功诱导重组载体pET-32a(+)/Luffin-β-KDEL-uPAcs表达相对分子质量约48.8×103含载体表达标签(Trx)的融合免疫毒素TELKP,EK酶切该蛋白获含290个氨基酸,相对分子质量约31.8×103的目的蛋白LKP。SDS-PAGE检测鉴定表明,LKP蛋白与预期大小一致,其纯度达98.8%。CCK-8、RT-PCR、Western blot等法检测显示,LKP经uPA酶体外裂解可释放具杀瘤活性的Luffin-β小分子毒素。结论成功克隆到Luffin-β-KDEL-uPAcs融合基因,并将其构建于原核表达载体pET-32a(+)中,且诱导该载体表达了相对分子质量约31.8×103的融合毒素LKP。LKP毒素经uPA酶体外裂解能释放具杀瘤活性的Luffin-β小分子毒素。

VEGF受体单抗与Luffin双靶融合毒素的构建及其对非小细胞肺癌细胞的抑制作用

目的构建含血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受体单链抗体(KDRscFv)、尿激酶纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,uPA)裂解位点(uPAcs)、丝瓜毒素(luffin-β)与KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)内质网驻留信号序列的双靶向融合毒素,并探讨其对非小细胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma,NSCLC)细胞的抑制作用。方法全基因合成KDRscFv基因,RT-PCR法克隆luffin-β,重叠PCR法将两基因融合,其连接部位与C端分别引入uPA裂解位点uPAcs与KDEL,形成融合基因KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL。将该融合基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转入大肠杆菌后,诱导其表达融合毒素蛋白Trx-EK-KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL(TEKPLK)并纯化TEKPLK。用肠激酶(enterokinase,EK)切割TEKPLK后,纯化与回收靶向融合毒素KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL(KPLK)。采用CCK-8(cell counting kit-8)、RT-PCR、Western blot等方法,体外检测靶向融合毒素KPLK经uPA酶裂解后释放Luffin-β对NSCLC细胞的抑制作用。结果成功诱导重组载体pET-32a(+)/KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL表达相对分子质量约7.5×104含载体表达标签(Trx)的融合毒素蛋白TEKPLK,EK酶切该蛋白获得相对分子质量约5.8×104的靶向融合免疫毒素KPLK。CCK-8法检测表明,KPLK毒素的杀瘤活性成剂量-效应关系,其IC50约为35 ng/mL;RT-PCR和Western blot检测结果显示,KPLK经uPA酶体外裂解后能释放细胞毒素小分子Luffin-β,上调瘤细胞促凋亡基因caspase-3及其蛋白的表达。结论成功构建了KDRscFv-uPAcs-Luffin-β-KDEL融合基因及其原核表达载体,并获得相对分子质量约5.8×104的靶向融合毒素KPLK,该毒素经uPA酶体外裂解后能释放具杀瘤活性的Luffin-β毒素小分子。