园艺专业研究生《基因工程实验技术》课程教学探索与实践

针对园艺专业研究生的特点和人才培养要求,分析了《基因工程实验技术》课程在理论和实验教学中存在的不足,结合笔者在该课程教学实践中积累的经验和体会,从课程的理论体系、实验设置、实施方案和考核制度几个方面进行了探索,提出了一套较为有效的教学体系.

植物蛋白酶抑制剂抗虫基因工程研究现状与对策研究

植物蛋白酶抑制剂基因作为一种抗虫基因,具有广泛的抗虫谱,并且与其他抗虫基因相比具有很大的优势。文章基于蛋白酶抑制剂的研究现状,分析蛋白酶抑制剂抗虫基因工程中存在的各种问题,提出了相应的解决方法。

两种冷季型草坪草的EMS诱变及突变体筛选

为确定甲基磺酸乙酯(EMS)诱变多年生黑麦草‘爱神特’(Lolium perenne‘Accent’)和高羊茅‘赤道’(Festuca arundinacea‘Equator’)种子的最佳条件,获得性状稳定的突变材料和后代。利用不同浓度EMS在不同时间下诱变两个草坪草种,根据半致死浓度确定诱变组合。通过形态学、SCoT分子标记和生理指标测定筛选M1和M2代突变苗。结果表明:使用0.8%EMS溶液处理两个草坪草种36 h后播种,发芽率接近50%,诱变效果最佳。以该参数大规模诱变后,M1代两个草坪草种诱变株移栽成活933株,再经短期干旱胁迫,共筛选出18株耐旱单株。对M2代诱变株形态学分析发现,有叶面狭窄型和根长增长型两种突变类型。利用SCoT分子标记技术验证M2代诱变株发现,筛选的5条SCoT标记引物对20份草坪草样品扩增后,多态性比率为84.09%。其中SCoT-35引物扩增产物条带最为清晰稳定,诱变株与野生型差异明显。M2代三叶期变异单株经干旱、高温胁迫处理后,丙二醛含量、脯氨酸含量及相对电导率呈升高趋势,叶绿素含量呈下降趋势。最终得到两株多年生黑麦草耐旱突变体A5和A8,1株高羊茅耐旱突变体B9;两株多年生黑麦草耐热突变体A8和B9,1株高羊茅耐旱耐热突变体B9。本研究结果为草坪草抗性品种选育提供了帮助。

植物物候对重庆主城区热岛效应的响应

为探究植物物候对山地城市内部热岛效应的响应特征,于2016年1月—2017年1月对重庆市主城区80种木本植物进行地面物候观测,同时利用Landsat 8热红外数据反演研究区地表温度,结合同时期地面实测气温,对研究区热岛强度等级进行划分,进而比较城市内部不同热岛强度等级下植物物候变化特征。结果表明,热岛过渡区与热岛区植物展叶期较凉岛区分别提前了5.1 d和8.1 d,初花期分别提前了4.0 d和20.8 d,终花期分别提前了4.8 d和11.6 d,而落叶期分别推迟了8.5 d和18.9 d,即城市内部热岛増温使植物春季物候提前,秋季物候推迟,生长季延长,且物候变化幅度随热岛强度等级增大而增大。不同功能型植物物候对热岛増温的响应存在差异,灌木、常绿植物和引种植物物候比乔木、落叶植物和本土植物更加敏感。本研究在一定程度上填补了我国西南山区物候研究的空缺,可为预测城市植物物候对未来山地城市小气候变化乃至全球气候变暖趋势的响应提供早期预警。

蜡梅花发育相关基因CpUFO表达特性与功能分析

【目的】UFO是被子植物中首个被发现的F-box蛋白,主要参与调控花分生组织特性和花器官发育。本文通过对蜡梅CpUFO基因表达特性分析及异源表达拟南芥表型分析,初步鉴定CpUFO的功能,为阐明蜡梅花发育分子调控机制提供参考。【方法】基于前期构建的蜡梅转录组数据,克隆蜡梅CpUFO基因并对其编码蛋白进行同源比对及进化树分析。根据qRT-PCR分析CpUFO基因在不同组织、器官及全年花发育各阶段中的相对表达量,比较35S::CpUFO转基因拟南芥株系及Col-0野生型表型差异,并通过qRT-PCR检测过表达拟南芥株系内源开花相关基因的表达特性,分析过表达CpUFO对拟南芥开花时间以及花器官发育的影响。【结果】获得的CpUFO基因cDNA序列为1665 bp,编码403个氨基酸,含有保守的F-box结构域。CpUFO在外花被片中表达量相对最高,其次是内花被片,在果、茎、叶、腋芽及雌雄蕊中表达水平较低;而在全年花芽中的表达量分析结果显示,低温打破休眠后的露瓣和始花以及盛开期花芽中的表达量显著高于其他时期。与野生型拟南芥相比,35S::CpUFO转基因株系莲座叶数目减少,开花提前,且拟南芥内源基因TFL1表达量下调,成花关键基因FUL和AP1的表达量上调。【结论】CpUFO在不同组织、器官及花发育各阶段均有表达,不同组织中在外花被片中表达量最高,全年花芽中打破休眠的花蕾开放阶段表达量最高。同时,过表达CpUFO会促进拟南芥早花并影响其花器官发育。

蜡梅转录因子CpBBX24基因的克隆及功能分析

【目的】BBX(B-box)是锌指结构蛋白转录因子家族中一个重要的亚家族,在植物生长发育、植物信号转导及逆境胁迫响应中具有重要的调控作用。对蜡梅BBX24基因的克隆与分析,有利于丰富植物中对BBX基因家族的认识,为蜡梅抗逆调节机制提供新的理论依据。【方法】以蜡梅转录组数据库中获得的蜡梅CpBBX24基因cDNA序列为基础克隆基因全长,使用DNAStar和MEGA进行序列分析和进化树构建。采用qRT-PCR进行蜡梅不同组织及不同花期表达特性分析,以及ABA、MeJA、干旱、高盐、高温和低温等处理后表达分析。同时,使用Gateway技术构建植物表达载体,花絮侵染法转化拟南芥,对T3代纯合系进行表型观察及非生物胁迫耐性分析。【结果】获得CpBBX24的cDNA序列长为1374 bp,包含729 bp的开放阅读框(ORF),编码242个氨基酸,分子量为26.54 kD,等电点为4.93。序列分析表明CpBBX24蛋白在N端有两个串联的B-box结构域,其C端不包含CCT结构域。表达特性分析表明,CpBBX24在蜡梅根、茎、子叶、幼叶、成熟叶各器官,外瓣、内瓣、雌蕊、雄蕊等组织中均有表达,其中在子叶中表达量最高。在不同开花时期,CpBBX24表达呈波动变化,在衰老期表达量最高。ABA、MeJA、干旱、高盐、高温和低温均能诱导CpBBX24基因的表达,表达趋势各有差异。在PEG(30%PEG-6000)、高盐(300 mmol·L^(-1)NaCl)、高温(42℃)、低温(4℃)胁迫下,转基因拟南芥处理后植株总体生长状态优于野生型,相对电导率和丙二醛浓度数值显著低于野生型,说明CpBBX24基因过表达增强了拟南芥的干旱、高盐、高温及低温胁迫耐性。【结论】ABA、MeJA、干旱、高盐、高温和低温等处理诱导了CpBBX24的表达,说明其可能参与蜡梅的逆境胁迫耐性调控。CpBBX24的过表达增强了拟南芥的干旱、高盐、高温及低温等胁迫耐性。这些结果表明CpBBX24基因在干旱、高盐、低温和高温等胁迫响应中发挥重要作用。

重庆地区黄葛树夏季光合日变化与主要环境因子的关系

于2011年7月中旬采用Li-6400便携式光合仪研究了夏季黄葛树净光合速率(Pn)和蒸腾速率(Tr)的日变化规律,探讨了Pn和Tr与主要环境因子的关系.结果表明:黄葛树Pn日变化为双峰型,有明显的"午睡"特征,为气孔限制因素所致;Tr日变化则为单峰型.黄葛树具有较低的光补偿点(LCP)和较高的光饱和点(LSP),分别约为21.33μmol/(m2.s)和1 633.46μmol/(m2.s),表观量子效率(AQY)约为0.034,为典型的阳生植物.相关分析、通径分析和决策系数分析显示:主要环境因子对Pn日变化直接作用大小为叶面温度(tl),空气CO2浓度(Ca),光合有效辐射(PAR)和水气压差(VDP),其中起主要决策作用的因子为PAR,主要限制性因子为Ca和VDP;对Tr日变化直接作用大小为胞间CO2浓度(Ci),光合有效辐射(PAR),空气相对湿度(RH),水气压差(VDP)和叶面温度(tl),其中起主要决策作用的因子为PAR,主要限制性因子为tl和Ci.

重庆地区加拿利海枣夏季光合日变化与主要环境因子的关系

于2010年7月中旬采用Li--6400便携式光合仪研究了夏季加拿利海枣净光合速率(Pn)和蒸腾速率(Tr)的日变化规律,探讨了Pn、Tr与主要环境因子的关系。结果表明:加拿利海枣Pn日变化为双峰型,有明显的"午睡"特征,为非气孔限制因素所致;Tr日变化则为单峰型。加拿利海枣具有较高的光补偿点(LCP)和光饱和点(LSP),分别约为34.30和1526.96μmol/(m2·s),表观量子效率(AQY)约为0.034,为典型的阳生植物。相关分析、通径分析和决策系数分析显示:主要环境因子对Pn日变化直接作用大小为空气CO2浓度(Ca)>光合有效辐射(PAR)>空气相对湿度(RH),其中起主要决策作用的因子为Ca,主要限制性因子为RH;对Tr日变化直接作用大小为叶片温度(tl)>RH>PAR>Ca>胞间CO2浓度(Ci),其中起主要决策作用的因子为PAR,主要限制性因子为tl。

蜡梅花蕾脱落力、扩张蛋白活性与离层形成相关性研究

为明确蜡梅花蕾脱落过程中脱落力、扩张蛋白活性以及离层发育的关系,同时研究保鲜剂对蜡梅切花的影响,采用查狄伦测力计以及蛋白体外重组法对瓶插蜡梅花梗脱落力和蛋白活性进行研究,同时采用石蜡切片法对瓶插蜡梅中蕾期花梗离层的形成进行观察。结果表明:1)脱落力与落蕾量呈负相关,当脱落力小于2.0 N时落蕾量显著增加;2)在瓶插前期,扩张蛋白活性稳定在相对较低的水平,到了后期活性迅速增强,此时脱落力显著下降,离区细胞严重解体并导致离区断裂;3)和对照相比,3种保鲜剂组合对蜡梅切花无显著影响。脱落力、扩张蛋白活性与离层发育关系密切,脱落力可以作为蜡梅花蕾脱落过程中离层发育阶段的划分依据,扩张蛋白主要在蜡梅花蕾离层发育后期起作用;3种保鲜剂组合对蜡梅切花作用不明显。

不同预处理液对蜡梅切花保鲜效果的研究

通过对瓶插植株瓶鲜重变化、瓶插寿命、开花率和萎蔫脱落率等综合指标的测定,分析不同预处理液对蜡梅采后衰老的生理效应。结果表明:7mg/L6-BA+200mg/L8-HQS+200mg/LSUC处理具有最佳的处理效果,对延缓蜡梅采后的衰老有明显效果。

植物几丁质酶及应用研究进展

几丁质酶作为一种重要的病程相关蛋白,一直是植物抗菌基因工程的研究热点之一。本文综述了植物几丁质酶的特性、分类、生物学作用以及基因的表达调控,重点介绍了植物几丁质酶的研究应用进展。随着研究的深入,植物几丁质酶在多个领域的应用研究也越来越受到关注,有着广阔的发展前景。

紫罗兰色素的提取和稳定性研究

以紫色紫罗兰花瓣为原料,采用溶剂提取法,通过单因素试验和正交实验,对紫罗兰色素的提取工艺进行优化,并对色素的稳定性进行了研究。结果表明:紫色紫罗兰花瓣色素最佳提取工艺为:丙酮为提取剂、1∶40料液比、3.0h提取时间、55℃温度下效果最好;该色素不耐高温,耐氧化性较弱,紫外光有明显减色作用,中性偏弱酸性下能保持稳定,葡萄糖、柠檬酸对其有保护作用;Fe3+对色素有较大影响。

Metallothionein克隆载体及表达载体的构建及转化矮牵牛的初步研究

Metallothionein基因位于文库克隆载体pTriplEx2上,活化菌液并用限制性内切酶SfiI酶切,同时酶切添加了SfiI酶切位点的环状pMD-18TM,回收目的片段和载体并连接,经过酶切和PCR验证,成功构建克隆载体;再用XbaI和SmaI分别双酶切克隆载体和表达载体pc2301,回收目的片段和表达载体并连接,经酶切和PCR验证,成功构建含有目的基因的表达载体,进而转化植物获得耐重金属的植物株系。初步验证转化后的植株具有抗击重金属的能力。

石榴种质资源遗传多样性及亲缘关系的ISSR分析

利用ISSR标记技术对47个石榴品种遗传关系进行了分析。筛选出多态性高的6条ISSR引物,共扩增出120条DNA条带,其中多态性带109条,多态性百分率为90.83%,有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样(H)、Shan-non信息指数(I)分别为1.294 5±0.309 4、0.189 7±0.161 8、0.309 1±0.219 8,遗传距离(Dg)变异为0.075 0～0.400 0,表明石榴品种间存在比较丰富的遗传多样性。利用UPGMA法构建分子树状图,将47个石榴品种分为5个类群。同时检测到15条特异性条带,可用于供试石榴中的11个品种鉴定的参考性标记。

四种野生百合核型分析

对南川百合(Lilium rosthornii Diels)、青岛百合(L.tsingtauense Gilg)、山丹(L.pumilum DC.)和岷江百合(L.regaleWilson)等4种野生百合进行了染色体数目观察和核型分析。结果表明,核型除山丹为3A外,其余3种材料核型均为3B。核型公式分别为:南川百合2n=2x=24=4m(4SAT)+2sm+6st+12t;青岛百合2n=2x=24=8m(4SAT)+2sm(2SAT)+14t;山丹2n=2x=24=2m(2SAT)+6sm(2SAT)+4st(4SAT)+12t;岷江百合2n=2x=24=2m(2SAT)+2sm+6st+14t。核型不对称系数分别是81.68%、76.09%、80.34%和82.26%。其中,南川百合和青岛百合为国内首次报道。

川滇石榴品种遗传多样性及亲缘关系的AFLP分析

石榴（Punica granatum）为石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica）落叶灌木或小乔木,原产伊朗、阿富汗等中亚一带,从西汉张骞出使西域将涂林安石榴引入我国,石榴作为水果和观赏树木在我国已有2000多年的栽培历史。经长期天然杂交和基因突变,以及采用实生、分株、嫁接等多种繁殖方法,产生了复杂而多样的品种和类型,据不完全统计,我国现有石榴品种资源200多个,遍及南北各地20多个省区,形成了山东枣庄。

蜡梅几丁质酶基因的克隆与原核表达

在构建好蜡梅花cDNA文库并进行EST分析基础上,通过随机克隆测序,得到1个蜡梅几丁质酶的cDNA基因,命名为Cpchia(GenBank登录号:FJ749130)。CpchiacDNA全长为1184bp,开放阅读框为954bp,编码317个氨基酸,其结构包括信号肽、几丁质结合域、可变交联区、催化区,无C端延伸区,为ClassⅠb型胞外几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。将Cpchia克隆到原核表达载体pET-28a(+),在大肠杆菌BL2l细胞中以包涵体形式表达融合蛋白,利用透析法获得复性蛋白,其几丁质酶活性经DNS法检测达到200U.mL-1。酶活性和稳定性分析表明,试验条件下,pH7.0有利于酶的稳定和活性发挥,40℃活性最高,在0℃低温下也有较高活性。上述结果说明,分离的Cpchia基因编码蛋白具有几丁质酶活性,而且可能与蜡梅花的抗寒性形成有关。

蜡梅凝集素基因克隆及其对蚜虫、蛞蝓抗性分析

【目的】克隆蜡梅凝集素基因并研究其抗蚜虫和抗蛞蝓活性,为植物抗虫基因工程提供理论依据和试验材料。【方法】通过随机挑选克隆测序的方法,从蜡梅花cDNA文库中克隆蜡梅凝集素基因,并构建植物表达载体,用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,并对转基因植株进行抗蚜和抗蛞蝓试验。【结果】从蜡梅花cDNA文库中克隆到了一个凝集素基因CpLEC(GenBank登录号:DQ352145),该基因全长871 bp,ORF框长558 bp,编码185个氨基酸。该基因DNA分析表明其不含内含子。具有单子叶植物甘露糖凝集素基因家族的特征,有2个典型的甘露糖结合位点(QXDXNXVXY),和1个变异的可能结合位点(HXGXNXVXY)。Southern杂交表明,该基因在蜡梅基因组中为多拷贝。构建了35S启动子控制下的CpLEC基因的植物表达载体pBI121-CpLEC,利用根癌农杆菌介导法转化烟草获得抗卡那霉素的植株。PCR和半定量RT-PCR分析表明,CpLEC基因已经整合到植物基因组中并在转录水平上得到了有效表达。抗蚜虫鉴定表明,转基因植株及其离体叶片有效地抑制了蚜虫的群体增长率,平均抑制率分别为60%和68%。抗蛞蝓试验结果表明转基因植株有明显的抗蛞蝓活性,转基因烟草虫害指数为0.17,远低于非转基因烟草的虫害指数0.96。【结论】克隆获得了蜡梅凝集素基因CpLEC,通过转基因手段分析其抗蚜和抗蛞蝓活性,结果表明该基因对抗虫基因工程有重要的应用价值。

2个蜡梅nsLTP基因启动子的克隆及其在烟草中的瞬时表达分析

利用hiTAIL-PCR法得到了2个蜡梅(Chimonanthus praecox)非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid transfer protein)基因家族成员CpLTP3和CpLTP4翻译起始位点上游启动子序列,长度分别为1298bp和838bp。生物信息学分析表明2个序列均存在启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。在烟草叶片中的瞬时表达结果表明这两个启动子序列均具备驱动报告基因GUS表达的功能。

梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

基于GenBank公布的葡萄糖基转移酶(LGT)基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以梁平柚成年树幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增葡萄糖基转移酶基因,将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmLGT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.经1.0mmol/LIPTG诱导表达获得大小约为62Kd的目的融合蛋白.