重庆地区鲫外寄生车轮虫形态分类学研究及一新种的描述(英文)

在对重庆地区进行鱼类寄生虫学的调查过程中,从鲫鳃表获得3种隶属于车轮虫属Trichodina Ehrenberg,1830的外寄生车轮虫,其中含一新种,短棘车轮虫Trichodina brevicirra sp.nov,其典型的鉴别性特征为其短细的齿棘。另外两种车轮虫分别为沃玛车轮虫Trichodina ngoma Van As&Basson,1992与网状车轮虫Trichodina reticulata Hirschman&Partsch,1955;沃玛车轮虫为亚洲新记录种。文章对网状车轮虫的3种群进行了详尽的比较讨论研究,尽管该三种群间存在着细微的种群内差异,但网状车轮虫的典型特征则显而易见地存在于三种群间,即为附着盘中央具有8-16个球状或卵圆形的中央颗粒。

原生动物基因组转座元件的研究进展

转座元件是一类广泛分布于真核生物的可移动的遗传因子,可以引起基因重组和变异,在物种进化及遗传改良中起着重要作用。针对近年来原生动物全基因组序列中大量发现的转座元件,文章着重比较了转座元件在锥虫、利什曼虫、微孢子虫、变形虫和滴虫基因组序列中的存在种类、分布特征及其功能意义。原生动物转座元件以LINE和SINE为主,其次是DNA转座元件和LTR反转座元件,部分转座元件在高A+T含量区富集,预示着转座元件与基因组序列A+T含量有着紧密联系。根据不同种微孢子虫基因组之间转座元件的差异,推测在微孢子虫基因组进化过程中,至少经历了一次转座元件的丢失事件。最后对转座元件在原生动物寄生虫的进一步研究和应用作了展望。

板栗树冠节肢动物群落季节动态研究

分别分析了群落总体及其亚群落数量季节动态以及群落结构特征的季节动态,共采集节肢动物136种,隶属于12个目、63个科。群落害虫优势类群为同翅目、鞘翅目和鳞翅目,天敌优势类群以蜘蛛目为主。节肢动物群落个体总数量两个高峰期分别出现在4月下旬和9月中旬,整个节肢动物群落的数量变化主要由同翅目特别是该目中蚜虫的数量变化而引起。害虫亚群落的个体数量变化左右了整个群落的数量变化,总群落的物种丰富度、多样性指数和均匀度指数与害虫亚群落的变化趋势较为一致。

重庆地区板栗园桃蛀螟发生与为害调查及药效试验

2001-2002年，对桃蛀螟在重庆地区板栗园的生活史、发生规律、生活习性、为害特点及其化学防治进行了研究。结果显示，桃蛀螟在重庆地区的生活史为每年发生4代，是重庆地区板栗园引起果实减产最主要的蛀果性害虫；7种药剂的药效试验表明，5.0％抑太保乳油和2.5％功夫乳油对桃蛀螟的防效较好。

家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白的原核表达及间接免疫荧光定位分析

【目的】家蚕微孢子虫Nosema bombycis ADP/ATP转运蛋白可能参与搬运宿主细胞的能量。本研究克隆家蚕微孢子虫ADP/ATP转运蛋白基因,并进行原核表达、抗体制备及间接免疫荧光定位,为控制和防治家蚕微粒子病提供理论基础。【方法】通过同源序列比对鉴定家蚕微孢子虫N.bombycis ADP/ATP转运蛋白序列,采用生物合成的方法将编码3段面向膜内侧肽段的核酸序列拼接合成,在其两端引入BglⅡ和SalⅠ酶切位点,克隆至pUC57载体并测序,再亚克隆至含有二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)标签的表达载体pQE40中,然后利用BamHⅠ和SalⅠ酶切获得含有DHFR标签的重组序列,并连接至pET30a(+)载体中进行诱导表达。通过SDSPAGE、镍柱亲和层析和免疫印迹法鉴定表达蛋白,利用间接免疫荧光对ADP/ATP转运蛋白的分布进行检测。【结果】家蚕微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白编码序列(GenBank登录号为EOB13854.1)全长1 524 bp,编码蛋白含有507个氨基酸残基,预测分子质量为59 kDa,等电点为9.35。具有12个跨膜结构域和TLC结构域,其中TLC结构域含有4个功能保守位点。与蜜蜂微孢子虫的ADP/ATP转运蛋白比较,氨基酸序列一致性达30%。系统进化分析表明微孢子虫ADP/ATP转运蛋白聚为一类,具有共同的起源。成功构建了NbADP/ATP-△TM-DHFR-pET30a原核表达重组质粒,目的基因获得表达,其融合蛋白分子量约为37 kDa,纯化重组蛋白并制备了多克隆抗体。免疫印迹分析表明,成熟微孢子虫中表达ADP/ATP转运蛋白;间接免疫荧光定位结果显示,家蚕微孢子虫孢子ADP/ATP转运蛋白定位于孢子质膜上。【结论】本研究将为阻断微孢子虫能量来源,达到控制和防治家蚕微粒子病提供新的思路。

不同肥料对池塘细菌种群的影响

运用PCR-DGGE技术分析有机肥(干鸡粪)和化肥(碳酸氢铵和磷酸一铵)对鱼苗池塘中的理化因子和细菌数量及其种群结构的影响,以探讨细菌种群结构对不同肥料的响应。结果显示:施肥后池塘中NH4+-N、PO43--P、NO 3--N和NO 2--N等浓度增加,透明度降低,细菌数量、种群多样性和丰富度指数均增加;化肥增加溶氧和升高pH,有机肥却降低溶氧和pH。施肥后蓝细菌门(Cyanobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)种群成为优势种群,有机肥能增加厚壁菌门(Firmicutes)种群的相对丰度,而化肥却降低其相对丰度;β-和γ-变形杆菌纲种群的相对丰度在施入化肥后增加,有机肥却限制γ-和δ-变形杆菌纲种群,化肥明显降低放线菌门种群的相对丰度。池塘中理化因子、细菌种群数量及其结构因施入不同肥料发生相应的变化。

家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶基因的克隆及表达和亚细胞定位

半胱氨酸脱硫酶是一类活性依赖于磷酸吡哆醛的酶类,可催化L-半胱氨酸转化为L-丙氨酸和硫烷硫原子,为铁硫簇组装提供硫原子。基于家蚕微孢子虫基因组数据,克隆了家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶(NbNfs)基因。序列结构分析显示NbNfs含有其活性所需的保守氨基酸位点,但不具有线粒体型N端导肽;系统发育分析表明微孢子虫半胱氨酸脱硫酶与真菌线粒体型半胱氨酸脱硫酶聚为一类,属于类群Ⅰ,起源于α-变形细菌;共线性分析表明半胱氨酸脱硫酶基因在不同微孢子虫之间其基因座位保守,具有共线性。构建重组质粒pET30a(+)-NbNfs,并转化到E.coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达NbNfs融合蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化后,将融合蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,Western blotting检测NbNfs在成熟家蚕微孢子虫具有表达。胶体金免疫定位显示NbNfs主要定位于成熟家蚕微孢子虫的细胞质中。研究结果为家蚕微孢子虫铁硫簇组装途径的研究奠定了基础。

家蚕微孢子虫蛋白水解酶的活性检测及质谱鉴定和序列分析

微孢子虫的蛋白水解酶类不仅参与代谢活动,而且可能作为一种潜在的侵染宿主的毒力因子。为了研究家蚕微孢子虫蛋白水解酶的种类及蛋白质结构特点,将家蚕微孢子虫总蛋白经非变性凝胶电泳后与底物酪蛋白孵育,检测到可水解酪蛋白的蛋白酶类的活性。采用质谱法分析该类蛋白酶主要是锌离子依赖型的细胞质型亮氨酰氨肽酶和丝氨酸蛋白酶。细胞质型亮氨酰氨肽酶序列是由1 515个碱基编码的505个氨基酸组成,无信号肽,有2个潜在的锌离子结合部位,属于金属蛋白酶M17家族;丝氨酸蛋白酶具有肽酶S8结构域和跨膜域。通过序列比对发现在兔脑炎微孢子虫、蝗虫微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、肠道微孢子虫和比氏肠道微孢子虫中均有这2种酶,且相似度较高,其进化较为保守。

家蚕微孢子虫CQ1分离株侵染家蚕的组织病理学观察

运用扫描电子显微镜以及组织切片、超薄切片结合透射电子显微镜观察家蚕微孢子虫CQ1分离株感染家蚕后的增殖与蚕体重要组织的病理变化,为利用CQ1分离株开展家蚕微孢子虫在宿主体内增殖和传播的分子机制研究提供较为详细的病理学依据。用扫描电子显微镜观察发现家蚕微孢子虫CQ1分离株添食侵染3龄起蚕后6 d,可在幼虫中肠中观察到增殖的孢子,并且发现孢子从围食膜穿出进入肠腔后留下的痕迹;感染后7 d发现中肠破损细胞内充满孢子;感染后8 d观察到中肠内有发芽的孢子空壳存在,说明从中肠释放出的孢子进入肠腔后,会部分发芽造成中肠再次感染。病理切片和超薄切片观察表明,3龄起蚕添食感染CQ1分离株孢子液后9 d,在中肠、脂肪体、丝腺的组织细胞内都存在大量的孢子,被感染的组织细胞肿大,同一细胞内充满不同发育时期的孢子,其裂殖体体积大于孢子体,大部分孢子在细胞内游离存在,脂肪体、丝腺的病理切片中无寄生泡结构;但在中肠组织切片以及脂肪体超薄切片中,发现有疑似寄生泡结构,特别是在透射电子显微镜下观察到感染的脂肪体细胞中这种疑似寄生泡结构呈椭圆形,大小为17μm×12μm,膜的结构清晰可辨,并可观察到泡内有10余个孢子。无寄生泡是微粒子属(Nosema)的主要特征之一,所以观察到的这种类似寄生泡的结构还需要进一步确证。

家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因对家蚕微孢子虫入侵的响应模式

为探究接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)24与48 h后,家蚕中肠6种丝氨酸蛋白酶基因(serineprotease gene,sps)的表达变化趋势,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法对正常组和微孢子虫感染试验组的6个家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因(编号分别为sp1、sp3、sp5、sp8、sp11和sp12)进行定量分析。结果显示,与正常家蚕中肠内丝氨酸蛋白酶基因的转录水平相比,sp1、sp3、sp5和sp12在接种家蚕微孢子虫24与48 h后均上调表达,其中sp5上调最明显,接种家蚕微孢子虫24与48 h的表达量分别是对照的1.9和1.2倍;sp8和sp11在受微孢子虫感染24 h后表达上调,而48 h后表达量下降。结果表明,丝氨酸蛋白酶(serineprotease,SP)参与了家蚕中肠对微孢子虫入侵的免疫反应;不同丝氨酸蛋白酶上调倍数不同,说明不同丝氨酸蛋白酶参与家蚕免疫反应的程度不同;家蚕微孢子虫侵染48 h后,sp8和sp11出现了下调,推测微孢子虫的成功入侵抑制了sp8和sp11的表达。家蚕中肠不同丝氨酸蛋白酶在微孢子虫感染的不同时间的表达变化趋势为进一步研究丝氨酸蛋白酶家族在家蚕微孢子虫与宿主家蚕互作中的作用奠定了基础。

基于18S rDNA遗传距离与GC含量对游走类纤毛虫的分子系统学研究（英文）

为了揭示游走类纤毛虫的系统发生,对寄生于淡水鱼类的车轮虫科中的6种车轮虫进行了18S rDNA的测序并获得了9个序列。采用了最大似然法(ML)与贝叶斯法(BI)对GenBank中所有游走类纤毛虫的18S rDNA序列进行了系统树的构建,并首次将SPSS与18S rDNA遗传距离结合分析了游走类纤毛虫的系统发生。研究结果进一步证实了车轮虫属(Trichodina)的非单系发生与小车轮虫属(Trichodinella)的有效性。此外,研究结合18S rDNA的GC含量与遗传距离分析提出了游走类纤毛虫科属及种间新的鉴定依据:18S rDNA的GC含量可用于游走类纤毛虫的科属区分,且与游走类纤毛虫的分化密切相关;18S rDNA的遗传距离在游走类纤毛虫的不同阶元中具有一定的阈值范围,即通常种内遗传距离阈值范围为0.000—4).005,属种间阈值范围为0.005—0.150,当遗传距离大于0.150时,则达到了科间水平。

食物泡在草履虫体内移行现象与伸缩泡频率的相关研究分析

草履虫不仅是动物学教学中的重要模式生物,也是科学研究的重要研究材料。本研究以草履虫为研究对象,通过其摄食消化现象及伸缩泡的伸缩频率的观察研究发现,伸缩频率的变化与摄食及消化状态之间存在一定的相关关系:形成食物泡时伸缩频率较高;食物泡堆积于体后端时,伸缩频率仍较高;食物泡在向体前方移行过程中,伸缩频率升高至最高值;食物泡从体前端向体后端开始移行时,伸缩频率开始降低;排出食物残渣时,伸缩频率降低至最低值。

柞蚕微孢子虫部分孢壁蛋白的分离鉴定及孢壁蛋白8的序列分析

研究柞蚕微孢子虫的孢壁蛋白组成和结构特点,有助于解明柞蚕微孢子虫在侵染过程中与蚕体细胞的互作机制。分别采用煮沸法和Laemmli法分离提取柞蚕微孢子虫总蛋白和孢壁蛋白,回收30kD左右的蛋白条带进行液质联用离子阱电喷雾质谱分析,获得的短肽序列经Mascot在线检索工具进行蛋白同源序列比对,共鉴定出27种具有功能注释的蛋白,有3种注释为孢壁蛋白。其中获得了与家蚕微孢子虫孢壁蛋白8(NbSWP8)高度同源的柞蚕微孢子虫孢壁蛋白8(NaSWP8)的基因全长序列。序列分析表明NaSWP8与NbSWP8的氨基酸序列相似性达到90%,且均具有特征性的肝素结合基序,二者的编码基因核苷酸序列的非同义替换率和同义替换率比值(dN/dS)明显小于1,表明孢壁蛋白8基因在2种蚕类微孢子虫中受到纯化选择压力的作用,基因的功能相对稳定。

微孢子虫O-甘露糖糖基化通路相关酶基因序列的比较分析

糖蛋白在免疫识别、信号转导等生命进程中扮演重要角色。为研究微孢子虫糖蛋白及其糖基化类型,采用比较基因组学方法对微孢子虫O-甘露糖糖基化通路进行分析。真核生物的O-甘露糖糖基化通路中有6种主要酶类,包括己糖激酶、磷酸甘露糖酶、GDP甘露糖磷酸化酶、Dol-P甘露糖合成酶、甘露糖转移酶、Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶。通过生物信息学方法分析家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)、蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis)、比氏肠道微孢子虫(Encephalitozoon bieneusi)和柞蚕微孢子虫(Nosema antheraea)的这6种酶基因编码氨基酸序列特征及结构域类型,发现这些酶的垂直同源基因比较保守,多重序列比对表明在6种微孢子虫之间,6种酶的氨基酸序列相似性比较高,系统进化分析显示同属的微孢子虫多聚为一簇。研究结果表明,N.bombycis、N.ceranae、E.cuniculi、E.intestinalis和N.antheraea 5种微孢子虫的O-甘露糖糖基化的蛋白质修饰通路是完整、保守的,然而在E.bieneusi中,其关键酶Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶的氨基酸序列比较短,只有342个氨基酸,缺失了关键结构域PMT,因此可能无法完成O-甘露糖糖基化修饰。以上微孢子虫的O-甘露糖糖基化通路中6种主要酶的序列信息,为后续解析家蚕微孢子虫糖基化通路及对糖蛋白糖基化类型与功能的研究提供了线索。

两株不同地域的家蚕微孢子虫分离株的细胞侵染力比较及遗传多样性分析

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是蚕业生产上一种毁灭性病害——微粒子病的病原体。文章将安徽和重庆两地域来源的病原性家蚕微孢子虫分离株进行草地贪夜蛾Sf9细胞感染性检测,结果显示二者对细胞的侵染能力存在显著差异。为进一步探讨不同家蚕微孢子虫分离株的种群多态性,进行了孢子虫核糖体DNA序列的测定和系统聚类比较,结果表明SSUrDNA(Small subunit ribosomal DNA)和ITS(Internal transcribed spacer)在不同地域的种群差异性并不显著。通过检索重庆株全基因组数据及其他地域株rDNA序列,显示在家蚕微孢子虫rDNA元件的部分SSUrDNA结构复制子中存在MITE-like转座元件的插入,表明家蚕微孢子虫rDNA结构的多样性。

南中国海野生海水鱼类外寄生车轮虫新记录(英文)

研究对采自南中国海的7种海水鱼类进行了调查研究,并分离获得4种隶属于车轮虫属的种类,分别为浦氏车轮虫Trichodina puytoraci Lom,1962;日本车轮虫Trichodina japonica Imai,et al.,1991;直钩车轮虫Trichodina rectuncinata Raabe,1958与鲀车轮虫Trichodina fugu Imai,et al.,1997。研究发现鲀车轮虫Trichodina fugu Imai,et al.,1997为寄主鱼虫纹东方鲀Takifugu vermicularis的病原,且能在野生条件下将其致死。上述4种车轮虫的形态分类学数据均基于干银法标本获得。研究是对我国南中国海车轮虫的首次报道。

一种适用于家蚕微孢子虫膜蛋白提取的方法

细胞膜蛋白在家蚕微孢子虫对宿主细胞的抵抗性、物质能量转运和信息传递过程中发挥着重要作用,也是家蚕微粒子病诊断防控的重要候选靶标。依次采用试剂盒直接抽提法、破碎抽提同步法、破碎抽提异步法,对家蚕微孢子虫膜蛋白提取过程中的抽提时间和孢壁处理方式进行优化,通过对提取蛋白质样品的质量检测,明确最佳提取方法。SDS-PAGE检测结果表明,采用破碎抽提异步法在Buffer 2B抽提40 min时能获得较高丰度的膜蛋白,与孢子总蛋白质相比,所得膜蛋白样品中含有丰富的大小为30～170 kD的差异蛋白,进一步利用已知家蚕微孢子虫膜蛋白——类枯草杆菌蛋白酶2的抗体(anti-Nb-SLP2)进行Western blotting分析发现,膜蛋白样品中含有丰富的NbSLP2,表明破碎抽提异步法适用于孢子膜蛋白的提取。此方法的建立将有助于对家蚕微孢子虫膜蛋白的鉴定和功能研究及检测防控候选膜蛋白靶标的筛选。

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)染色体DNA的分离纯化

为了获取可供家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)单染色体测序的基础材料,通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分离家蚕微孢子虫CQ1株系的染色体DNA,随后切取含有目的染色体DNA条带的琼脂糖胶块,分别利用电洗脱法、柱式胶回收试剂盒法及玻璃奶胶回收试剂盒法进行染色体DNA的分离纯化实验。结果显示3种方法均能回收到目的染色体DNA,但分离纯化的效率和样品质量存在差异:电洗脱法对胶块中的DNA损失较大,回收的染色体DNA含量低,而柱式胶回收试剂盒回收的染色体DNA断裂严重,因此这2种方法获得的样品质量均达不到染色体建库测序的要求;通过优化后的玻璃奶胶回收试剂盒法获得的染色体DNA相对完整且污染较少,质量检验分析133μL样品中的DNA质量浓度为8.495 ng/μL(DNA总量1.13μg),达到后续构建染色体测序文库的要求。玻璃奶胶回收试剂盒法不仅适用于家蚕微孢子虫染色体DNA的分离纯化,也可供基因组较小的物种制备单染色体建库测序材料参考。

家蚕微孢子虫NbTom40的原核表达及定位

线粒体外膜易位酶是由Tom40基因编码的位于线粒体外膜上的转位酶复合体,能够将外界蛋白质转位运输到线粒体基质中.最近有研究称在一类仅具有简缩进化的线粒体——纺锤剩体的感染家蚕微孢子虫的基因组鉴定到一个NbTom40基因.本文首先通过克隆了长度为839bp的NbTom40基因,通过构建重组载体pET30a(+)-NbTom40,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,经过HIS抗体的免疫印迹对表达的目的蛋白——31～43kDa间存在一条单一条带进行验证,结果显示该条带即为分子量大小正确的带有HIS标签的目的蛋白,然后将其进行Ni-NTA亲和层析以及聚丙烯酰胺凝胶纯化并制备多克隆抗体.NbTom40抗体与家蚕微孢子虫总蛋白的Western Blotting结果显示,在32kD处有明显杂交信号,与理论分子大小一致.最后,通过间接免疫荧光(IFA)对该基因编码的蛋白进行细胞定位,观察到NbTom40以散点状荧光信号分布在孢子内部.本研究为深入了解纺锤剩体的蛋白组成及其膜转运的分子机制奠定了分子生物学基础.

寄生于罗非鱼的刺纹车轮虫种群分析及其寄主偏好性研究

文章在刺纹车轮虫Trichodina centrostrigata Basson,Van As&Paperna,1983的重描述基础上,基于形态学特征、分子特征及系统发育分析,对其种群多样性及寄主偏好性进行了研究。结果表明,刺纹车轮虫三个种群:Trichodina centrostrigata(KP295473)、Trichodina centrostrigata(W)和Trichodina centrostrigata(Q)在历经4年的时间里,未发生明显的种群分化;其次,刺纹车轮虫与寄生于海水寄主的车轮虫聚支,表明二者具有较近的亲缘关系;再次,刺纹车轮虫主要寄生于鲈形目的广盐性罗非鱼,少数寄生于其他淡水鱼类,具有较强的寄生特异性;最后,此研究中的寄主罗非鱼对于刺纹车轮虫具有100%的高感染率,表明刺纹车轮虫为罗非鱼养殖业中一类潜在病害性微生物。