嗜水气单胞菌重庆WL3-X2分离株灭活疫苗对大鲵的免疫保护效果的研究

为评估重庆地区分离的嗜气单胞菌WL3-X2分离株对大鲵的免疫原性，本研究将嗜水气单胞菌WL3-X2分离株经福尔马林灭活，作为免疫原，通过腹腔注射途径间隔2周两次免疫健康大鲵，并检测其体内血清抗体、溶菌酶、补体C3及其免疫保护效应。结果显示，免疫嗜水气单胞菌灭活菌能够显著提高大鲵血清抗体滴度、溶菌酶活性和补体C3含量，首免35 d后这3项指标均达到峰值。此外，对初免4周后的大鲵经肌肉注射0.2 mL浓度为1.0×10^8 cfu/mL剂量的嗜水气单胞菌WL3-X2分离株，进行攻毒保护试验。结果表明，免疫组的相对免疫保护率为66.7 %。本研究结果表明，嗜水气单胞菌地方分离株灭活菌对大鲵具有显著免疫保护效力，可以作为大鲵预防嗜水气单胞菌感染的候选疫苗。

中国大鲵主要传染病病原研究进展

中国大鲵（Andrias davidianus），俗名“娃娃鱼”，属国家二级保护动物，是个体最大的两栖动物，也是我国珍稀名贵特产，已被列入CITES公约附录I中。自20世纪80年代后，由于环境人为破坏、过度捕捞等原因，大鲵栖息地范围严重缩小，自然资源数量急剧减少。

不同规格大鲵消化酶活性的比较研究

为探究不同规格大鲵消化酶活性,测得常规养殖大鲵的生长指标及50、500、1500、4500g 4种规格大鲵的胃、前肠、中肠、后肠的胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶及淀粉酶的活性。试验结果显示,大鲵体质量与体长呈幂函数相关,m=7.1789L0.1102x(r2=0.9009,n=38);胃蛋白酶、胰蛋白酶活性随着体质量增加而升高;胰蛋白酶及淀粉酶活性:前肠>中肠>后肠;各个肠段脂肪酶活性无明显差异。

棘腹蛙生物学特性及资源保护研究进展

棘腹蛙(Quasipaaboulengeri)是无尾目(Anura)叉舌蛙科(Dicroglossidae)棘胸蛙属的两栖动物。因其以农业和森林害虫为食且对生存环境要求高的特点,故有保护和监测环境的生态功能。但由于生态环境恶化和过度捕捉等原因,造成野生棘腹蛙数量急剧下降,被《中国脊椎动物红色名录》列为易危种。本文从棘腹蛙的习性、生存环境特征、系统进化、人工养殖和资源保护等方面进行了综述,为进一步研究棘腹蛙提供基础资料和理论依据。

金黄杆菌感染棘腹蛙的分离鉴定

棘腹蛙又名石坑、石蛙等,隶属无尾目、蛙科、棘蛙属,是我国特有的珍稀两栖动物[1],主要分布在湖南、湖北、四川以及甘肃等省[2]。由于环境污染严重、野生栖息地遭受破坏、人类大肆捕杀,棘腹蛙野生种群数量大量减少[3]。为保护其野生资源,同时满足市场需求,棘腹蛙的人工养殖逐渐受到重视。2014年以来,重庆地区部分养殖场出现大量棘腹蛙出血死亡的病例,给棘腹蛙养殖带来巨大经济损失。

棘腹蛙“水肿病”病原的分离鉴定

为了解重庆地区部分棘腹蛙养殖场"水肿病"病因,并对该病的临床防控提供参考,本研究采集了10只具有"水肿病"典型症状的2岁龄棘腹蛙成蛙,剖检后从其主要病变组织分离细菌;对分离的优势菌进行培养特性观察和回归致病性试验,同时进行生理生化特性鉴定、16SrDNA序列测定和药敏试验。结果显示,从病蛙腹腔中分离到1株优势菌株并命名为CQWU201501,该菌为革兰阴性无芽胞短杆菌,主要生理生化特性符合弗氏柠檬酸杆菌的指标,16SrDNA序列与弗氏柠檬酸杆菌同源性高达99.5%;药敏试验显示该菌对绝大部分β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类和四环素类药物敏感。综上所述,棘腹蛙"水肿病"是由弗氏柠檬酸杆菌引起的;该菌对供试的16种药物敏感,仅对头孢唑啉和复方新诺明2种药物耐药,生产上可选择敏感药物治疗。

感染棘腹蛙的腐败希瓦菌的分离与鉴定

为了弄清重庆地区部分养殖场流行的致棘腹蛙食欲废绝而死亡的病因,研究采用细菌分离纯化、形态观察、致病性试验、生理生化特性鉴定、16S r DNA测序鉴定和药敏试验等方法对其进行了研究。结果表明:在患病棘腹蛙舌部、食道、胃和肠道都分离得到形态弯曲的革兰阴性短杆菌;该候选菌株CQWU201405为腐败希瓦菌(Shewanella putrefaciens),是导致棘腹蛙发病的病原;在供试的18种药物中,该菌仅对磷霉素表现出明显的耐药现象。

大鲵肺炎克雷伯菌的部分生物学特性与致病性分析

为确定从患病大鲵分离鉴定到的肺炎克雷伯菌的生物学特性及其对大鲵的致病性,本研究采用比色法和平板扩散法对肺炎克雷伯菌的生长条件及胞外产物进行研究,并对人工感染该菌的大鲵主要靶器官进行组织病理学分析。结果表明:肺炎克雷伯菌最适宜在37℃、pH7.5和1.0%NaCl浓度的条件下生长;其胞外产物具有脂肪酶、蛋白酶、卵磷脂酶活性,无淀粉酶、明胶酶、脲酶及溶血活性;感染该菌后大鲵各器官均表现出不同程度的炎性反应,其中以肝炎和坏死性脾炎最为明显。本研究确定了肺炎克雷伯菌的最适生长条件,分析了其胞外产物主要成分,并对其感染大鲵后主要靶器官的组织病理变化进行了探究,为该菌的有效防控与致病机理的研究奠定了基础。

中国大鲵“烂脚病”病原菌的分离鉴定

为了解重庆地区部分中国大鲵(Andrias davidianus)养殖场流行"烂脚病"的病因,对患"烂脚病"中国大鲵进行剖检后,在其肺部分离到一株优势菌CQWU2013,对该优势菌进行致病性实验、生理生化特性鉴定、16S r DNA测序和药敏实验。结果显示:中国大鲵"烂脚病"是由肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella mobilis)引起的,该菌为短链状排列的革兰氏阴性杆菌,其生理生化特性符合肺炎克雷伯氏菌的指标,16S r DNA序列同源性高达99.6%;药敏实验显示该菌对部分青霉素类、β-内酰胺类、氨基糖苷类和糖肽类药物耐药,对供试的20种药物中有7种药物出现明显的耐药现象。

棘腹蛙Japonicin-pb抗菌肽的分离及表达谱分析

本试验旨在克隆棘腹蛙来源Japonicin-pb,了解该抗菌肽在不同生长温度及组织下的表达规律,为Japonicin-pb的开发提供线索。基于本实验室构建的棘腹蛙皮肤转录组数据库,利用反转录PCR从棘腹蛙皮肤组织中克隆Japonicin-pb前体序列,通过结构域比对的方法分析其结构。利用Real-time PCR检测3种Japonicin-pb在不同生长温度(15、18、21、24、27和30℃)及组织(血液、肌肉、肝脏和皮肤)的表达图谱。结果表明,本试验克隆到3种Japonicin-pb前体序列,结构域比对表明,三者拥有相同的N端信号肽和中间间隔区,长度分别为19、20和12个氨基酸残基的肽序列,命名为Japonicin-1apb、Japonicin-1bpb和Japonicin-3pb。Japonicin-1apb主要在皮肤组织中表达,且表达量随着生长温度的升高而逐渐增加;Japonicin-1bpb在不同组织或生长温度下的表达量差异均不明显;Japonicin-3pb主要在肝脏中表达,且生长温度对其影响不大。这些结果为棘腹蛙源3种Japonicin-pb后续功能研究以及开发应用提供了重要的序列及表达谱信息。

棘腹蛙皮肤抗菌肽Cathelicidin-Pb的克隆及表达分析

基于棘腹蛙(Paa boulengeri)皮肤转录组数据库,釆用RT-PCR方法从棘腹蛙皮肤组织中克隆到了编码Cathelicidin-Pb前体的核苷酸序列,其完整ORF长度为441 bp,编码146个氨基酸残基。通过信号肽预测和结构域查找比对,发现Cathelicidin-Pb前体包含N端20个氨基酸残基的信号肽、101个氨基酸残基的中间间隔区(cathelin结构域)和25个氨基酸残基的成熟抗菌肽。进一步研究发现,在适度高温范围内,皮肤组织中Cathelicidin-Pb的表达随着生长环境温度的升高而逐渐增加,但是当环境温度超过27℃后,其表达量急剧降低;Cathelicidin-Pb主要在皮肤组织中表达,在肌肉组织和血液组织的表达量较低。这些结果为棘腹蛙养殖过程中疾病控制及Cathelicidin-Pb抗菌肽的后续开发提供了重要的线索。

维生素E对泥鳅生长性能及消化酶活性的影响

选取平均体重为(1.58±0.01)g的健康泥鳅540尾,随机分为6组,每组3个重复,每个重复30尾,对照组饲喂基础饲料,试验A、B、C、D、E组饲料中维生素水平分别为24.375、48.75、97.5、195、390 mg/kg,试验期为30 d。结果表明:当维生素E水平为195 mg/kg时,增重率(WG)、特定生长率(SGR)和蛋白质效率(PER)均达到最大值,饲料系数(FC)达到最小值,分别为112.74%、2.51%、241.23%和2.15,均与对照组差异显著(P<0.01)。维生素E对泥鳅肠道消化酶活性影响显著,195 mg/kg添加组肠道蛋白酶和淀粉酶活性最高而脂肪酶活性最低,分别为14.96、0.206、20.86 U/g prot,均与对照组差异极显著(P<0.01)。维生素E分别与增重率、特定生长率、蛋白质效率、饲料系数进行回归分析并考虑维生素E对泥鳅消化酶活性的影响,确定泥鳅幼鱼维生素E适宜需要量为156～196.28 mg/kg。

一例棘腹蛙“白内障”的病原分离鉴定

在患"白内障"棘腹蛙眼部、口腔和胃部分离到一株圆形或椭圆形、葡萄状堆积的革兰氏阳性菌,经培养特性观察和致病性实验,确定候选菌株CQWU201401为"白内障"的病原;通过针对该菌株的生理生化特性鉴定和16S rDNA测序鉴定结果判定该候选菌株为金黄色葡萄球菌。采用药敏纸片法对该菌株进行药敏试验,在10种药物中的仅对四环素有耐药现象;针对该病原菌的分离鉴定和药敏试验为临床上防治该病提供了参考。

利用RNA-seq技术分析棘腹蛙编码区微卫星特征

棘腹蛙Paa boulengeri的遗传研究和基因组信息比较匮乏,致使可有效利用的分子标记非常有限。以棘腹蛙RNA-seq高通量测序数据为基础进行微卫星分子标记的大规模发掘和特征分析,结果显示：在121.6 Mb的棘腹蛙转录组序列中发现微卫星位点3165个,包含于3034条Contig序列中。在筛选到的1~6碱基重复核心的微卫星中,单碱基重复核心的比例最高,之后为三碱基、二碱基、四碱基、六碱基和五碱基重复核心,分别占29.0%、25.2%、21.7%、10.0%、10.0%和3.0%。其中A/T、AC/GT、AGG/CCT、ACAT/ATCT、AAAAT/ATTTT和AAAAAG/CTTTTT分别是单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、五碱基、六碱基重复类型中对应的优势重复单元。棘腹蛙编码区微卫星多为重复长度小于24 bp的短序列,长度大于24 bp的微卫星仅占总数的0.92%。对编码区微卫星的侧翼序列分析发现,微卫星侧翼序列的GC含量显著低于转录组整体GC含量,且在含有微卫星上下游侧翼序列的Contig中,71.9%的序列可以设计特异引物扩增出含有微卫星序列的位点。研究结果为棘腹蛙的遗传研究和分子系统地理学研究提供了丰富的序列信息和标记资源。

大鲵肠炎病原菌的分离鉴定与药敏试验

为了确定大鲵(Andrias davidianus)肠炎的病原菌,试验采用微生物学方法从重庆奉节疑似大鲵肠炎的病鲵体内分离到1株细菌,命名为CQWL008,对患病大鲵的临床症状和分离株的形态特征、培养特性进行观察,并进行生化鉴定、人工感染等试验。结果表明:大鲵肠炎的病原菌为肠型点状气单胞菌;该分离株对大黄、黄芩均具有敏感性,对五倍子高度敏感。

棘腹蛙生长激素/类胰岛素样生长因子轴关键基因的克隆与序列特征分析

机体的生长激素(GH)/类胰岛素样生长因子(IGFs)轴由GH系统和IGFs系统构成,可促进细胞增殖、调节生长发育、调控生理代谢,在机体生长发育调控方面有着重要作用。为明确棘腹蛙GH/IGFs轴的功能结构和进化特征,为棘腹蛙生长发育调控方面的研究提供理论依据,本试验对棘腹蛙GH、类胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)和类胰岛素生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)进行克隆并对其序列特征进行分析。结果显示:1)与两栖类模式动物的多重序列比对发现,棘腹蛙GH、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ的功能结构域严格保守,具有一定的遗传多态性;IGF-Ⅱ的N端呈简缩进化趋势。2)遗传进化聚类分析发现,棘腹蛙IGFs与两栖动物聚为一支,并与硬骨鱼相对近缘,说明IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ进化地位相对原始;棘腹蛙GH则与蛙类、鱼类等水生动物相对近缘,暗示该基因具有趋同进化趋势。3)为进一步明确上述基因的特异性功能位点,利用Swiss-model server软件解析其蛋白质结构,最终确定IGF-Ⅰ的THR52、LEU53、PHE72、PHE73、SER74为潜在的功能分化位点,IGF-Ⅱ的TYR81、LYS82、LYS83为潜在的功能分化位点,GH的PHE208为潜在的功能分化位点。由此可知,棘腹蛙GH/IGFs轴的主要基因相对保守,但与已知模式物种相比,存在潜在的功能分化位点,可作为后期棘腹蛙GH/IGF轴功能研究和遗传进化特征分析的分子靶标。

棘腹蛙TNFα基因的克隆与序列分析

为了解棘腹蛙TNFα基因的相关信息,对棘腹蛙的TNFα基因进行了克隆和序列分析。克隆了全长为936 bp、ORF长度为675 bp的TNFα-Pb基因;对该基因的蛋白质结构分析显示,TNFα-Pb的信号肽由44个氨基酸组成,随后由2个α螺旋,和10个β折叠形成小分子蛋白;系统进化分析发现,TNFα-Pb与两栖类聚为一枝,与高等哺乳动物存在功能分化的可能。本研究为了解棘腹蛙的生物反应调节机制奠定了一定基础。

棘腹蛙TGF-α基因的克隆与组织表达分析

为了解棘腹蛙TGF-α基因信息和组织表达特性,采用RT-PCR克隆棘腹蛙TGF-α全长序列,发现棘腹蛙TGF-αc DNA全长1 021 bp,开放阅读框为486 bp,编码161个氨基酸,预测分子质量为17.28 k Da,其氨基酸序列与其他物种的相似性为65%~73%;利用实时荧光定量PCR方法对该基因的表达情况进行分析,发现在肝脏和胃脏有较高表达。本研究克隆了棘腹蛙TGF-α并对其组织分布进行了分析,为后期深入挖掘棘腹蛙TGF-α的生物学功能提供了参考。

长薄鳅的常见疾病及其防治技术

长薄鰍(Leptobotia elongata)俗称薄花鳅、红沙鳅钻l花鱼,隶属鲤形目(Cyriniformes)鳅科(Cobitidae)沙鳅亚科(Botinae)薄鳅属(Leptobotia),是分布于长江中上游及其支流水域中的温水性经济鱼类,在长江物种多样性保护中具有重要地位。长薄鳅喜底栖于缓流处的石砾间,在鳅科中属于生长速度最快,个体生长程度最大的种类。

棘腹蛙剪接因子SRSF2基因克隆及序列分析

为了解剪接因子在棘腹蛙发育过程中的功能,首先基于棘腹蛙转录组数据库的组装结果设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆到棘腹蛙体内编码丝氨酸/精氨酸富集剪接因子2(Serine/Arginine-rich splicing factor 2,SRSF2)的完整开放读码框(ORF),其ORF长度为642 bp,编码213个氨基酸残基,利用数字表达谱和半定量RT-PCR的方法验证了SRSF2在不同温度下的表达图谱,对克隆到的SRSF2基因进行了内含子分析。结果表明:SRSF2在不同生长温度(15,21,27,30℃)下的表达量存在显著差异,在21℃环境下的表达量最高,而在15,27,30℃生长环境下的表达量都较低。说明棘腹蛙来源的SRSF2基因ORF序列内包含个1内含子和2个外显子。