梅毒螺旋体TpN15-47融合基因原核表达系统的构建

目的构建梅毒螺旋体TpN15-47融合基因及其原核表达系统。方法分别克隆TpN15和TpN47基因,利用T4连接酶构建TpN15-47融合基因,常规方法构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白TpN15-47表达情况。结果连接的TpN15-47基因测序分析表明,插入的基因片段为TpN15-47融合基因,与GenBank报道相同。目的重组蛋白TpN15-47表达产量约为细菌总蛋白85.79%,主要以包涵体形式存在。结论所构建的原核表达系统能高效地表达TpN15-47融合蛋白,为后期梅毒螺旋体基因疫苗和临床检测试剂盒的研制奠定了基础。

TpN47重组抗原的表达及其产物反应原性的初步鉴定

目的探讨梅毒螺旋体外膜蛋白(TpN47)重组抗原及其临床意义。方法采用PCR技术扩增TpN47重组抗原,再进行T-A克隆及测序,然后亚克隆至原核表达载体中,以亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白作为抗原制备酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒,对正常人血清200份、类风湿性关节炎(RA)阳性血清55份、系统性红斑狼疮(SLE)阳性血清34份及梅毒可疑患者阳性血清135份进行检测,其结果与梅毒血凝试验(TPHA)、梅毒甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)的检测结果进行比较。结果成功地构建了pET32-TpN47重组表达载体,重组的TpN47蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达。对梅毒可疑阳性血清采用ELISA、TPHA、TRUST检出阳性率分别为81.48%、98.52%、71.11%;TRUST测出的8份可疑阳性样品及31份阴性样品TPHA检测结果均为阳性,而ELISA检测结果阳性19份。ELISA检测阳性率与TRUST和TPHA比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论TpN47重组抗原具有较好的免疫反应活性,ELISA试剂特异性、敏感性次于TPHA,但明显高于TRUST。

TpN17重组抗原的表达及在梅毒血清学诊断中的初步应用

目的用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN17重组抗原,并建立操作简便、特异性好、敏感性高的梅毒血清抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。方法采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN17基因,再进行T-A克隆及测序,然后亚克隆到原核表达载体中,以亲和层析法纯化重组蛋白。将重组蛋白包被于反应板,建立检测血清中梅毒抗体的ELISA间接检测法,利用该法与梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)、甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)同时检测血清样品,对其结果进行比较研究。结果TpN17重组蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达,并成功建立了检测血清中梅毒抗体的ELISA间接检测法及试剂。对135例梅毒可疑患者血清进行检测,ELISA、TPHA和TRUST的检出阳性率分别为82.96%、98.52%和71.11%,而TRUST测出的8例可疑样品及31例阴性样品中,TPHA结果全部阳性、而ELISA只有2例阴性。结论TpN17重组抗原ELISA试剂在特异性和敏感性上明显优于TRUST法。

全血培养对体外培养PBMC细胞凋亡的影响

目的 :了解不同的体外培养方法对健康青年人外周血单个核细胞 (PBMC)凋亡的影响。方法 :通过用RPMI 1 6 4 0培养基和RPMI 1 6 4 0中混入不同比例全血 (1∶1 0 ,1∶5 )的培养基来培养PBMC ,用流式细胞术(FCM)观察 2 4h细胞凋亡发生的情况 ;并同时用ELISA法观察细胞培养上清中TNF的水平。结果 :三种培养基培养 2 4h后PBMC的凋亡率分别为 (1 2 .0 4± 4 .38) %,(7.2 1± 2 .1 6 ) %和 (2 .38± 0 .6 8) %,含全血的两组与RPMI 1 6 4 0组差异显著 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1 ) ;三种培养基培养PBMC 2 4h后细胞上清液TNF分别为 (2 .89± 1 .4 3) ,(5 .1 5± 1 .84 )和 (6 .5 2± 3.0 6 ) (ng/ml) ,两全血培养基组与RPMI 1 6 4 0组差异显著 (P <0 .0 1 ) ,而两全血培养基组间差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 :混入全血的培养基对培养PBMC细胞凋亡的影响小于单纯RPMI 1 6 4 0培养基。

梅毒螺旋体TpN15重组抗原的克隆与表达

目的：用基因工程技术表达梅毒螺旋体TpN15重组抗原，为进一步研制梅毒螺旋体疫苗和ELISA诊断试剂盒奠定基础。方法：采用PCR技术扩增梅毒螺旋体TpN15基因，进行T-A克隆及测序，然后亚克隆到原核表达载体中，以亲和层析法纯化重组蛋白。结果：成功地构建了pET32-TpN15重组表达载体，TpN15重组蛋白在大肠杆菌BL21中得到稳定表达。结论：梅毒螺旋体TpN15基因在大肠杆菌中的成功表达为临床检测梅毒感染的新方法和梅毒螺旋体疫苗的研制奠定了基础。

ltB-TpN47融合基因原核表达系统的构建

目的分别从梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)临床菌株和大肠杆菌DNA中扩增ltB和TpN47基因,构建ltB-TpN47融合基因及其原核表达系统。方法采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增TpN47基因和ltB基因片段、构建ltB-TpN47融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。采用质粒pET32和宿主菌E.coliBL21DE3构建ltB-TpN47融合基因原核表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达。结果所构建的ltB-TpN47融合基因核苷酸序列与从GeneBank中查询并处理得出的数据基本一致。所构建的表达系统pET32-ltB-TpN47的目的重组蛋白(rltB-TpN47)表达量高达细菌总蛋白的1/3左右。结论本文成功地构建了ltB-TpN47融合基因高效原核表达系统。

布地奈德对哮喘大鼠IKK/NF-κB信号通道影响的实验研究

目的:观察布地奈德混悬液(Bud,商品名:普米克令舒)对哮喘大鼠肺组织IκB激酶(IKKβ)mRNA表达及核转录因子(NF-κB)活化的影响。方法:复制哮喘大鼠模型,分为正常组、哮喘组和布地奈德混悬液雾化组,用原位杂交法检测肺组织IKKβmRNA表达,免疫组化检测肺组织NF-κBp65蛋白活性,双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)检测血清及支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL5的浓度。结果:哮喘组肺组织IKKβmRNA(0.203±0.038)及NF-κBp65(0.256±0.063)表达量均显著高于正常组(分别为0.015±0.006,0.034±0.008,P<0.01)。布地奈德混悬液雾化组肺组织IKKβmRNA(0.101±0.010)和NFκBp65(0.062±0.014)表达均显著低于哮喘组(P均<0.01)。结论:哮喘组肺组织IKKβmRNA、NF-κBp65表达显著增强,Bud雾化吸入能有效抑制哮喘大鼠肺组织IKKβmRNA的表达及NF-κBp65的活性,证明Bud能有效抑制IKKNFκB信号通道的活性。

孟鲁司特和卡介苗多糖核酸对哮喘大鼠血单个核细胞中STAT5b mRNA和IL-4 mRNA表达的影响

目的研究孟鲁司特和卡介苗多糖核酸对哮喘大鼠血单个核细胞中信号转导子和转录激活子5b(STAT5b)mRNA和白细胞介素4(IL-4)mRNA的转录表达的影响。方法52只体重为140~200g清洁级Spra-gue-Dawley雄性大鼠,随机分为4组:哮喘组、孟鲁司特组、卡介苗多糖核酸组和正常对照组。用卵白蛋白制备大鼠哮喘模型。计数血中嗜酸性粒细胞(EOS);应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验测定血浆中IL-4和γ-干扰素(IFN-γ)浓度;采用SYBR GREENI荧光实时定量PCR法测定STAT5b mRNA和IL-4 mRNA的相对表达量。结果哮喘组血单个核细胞中STAT5b mRNA和IL-4 mRNA的表达量高于其他各组(P<0.01);在孟鲁司特组和卡介苗多糖核酸组中两者的表达量相近(P>0.05)。哮喘组除了IFN-γ水平低外,其余无论是STAT5b mRNA,IL-4 mRNA,EOS绝对值等都是4组中最高的(P<0.01);除哮喘组外,其余组的各项指标相近(P>0.05)。②STAT5b mRNA表达量与IL-4 mRNA表达量、IL-4浓度、EOS绝对值呈正相关(P<0.01),与IFN-γ浓度...