布鲁氏菌DnaK基因缺失株的构建及其功能初步评价

为获得毒力较弱并能够区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究采用PCR方法扩增布鲁氏菌疫苗株DnaK基因上下游同源臂序列及卡那基因序列,并利用融合PCR将以上基因序列融合,构建p DM18-T-ΔDnaK-Kana打靶载体。电转化至布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选该菌疫苗株M5-90的DnaK基因缺失株,并对获得的M5-90ΔDnaK遗传稳定性、生长曲线、毒力和细胞免疫指标进行检测。结果表明,M5-90ΔDnaK与M5-90体外生长曲线相似, M5-90ΔDnaK在胞内的存活能力显著低于M5-90 (p<0.05), M5-90和M5-90ΔDnaK诱导小鼠血清IFN-γ水平相似(p>0.05),并且均显著高于PBS组(p<0.01)。结果表明,M5-90ΔDnaK有望成为毒力低且可诱导机体细胞免疫的疫苗候选株。本研究为布鲁氏菌致病机制的研究和疫苗的研发提供科学依据。

NF-κB信号通路调控绵羊肺炎支原体感染宿主肺泡上皮细胞的作用机理

分析转录因子细胞核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路在绵羊肺炎支原体感染肺泡上皮细胞中的分子机制.用不同浓度的抑制剂BAY11-7082与细胞孵育,用Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide(MTT)法检测细胞活性,以及用实时定量PCR检测NF-κBp65和白细胞介素-8(IL-8)mRNA的表达水平,用试剂盒检测caspase-3的活性和H2O2浓度变化,接着用细菌计数检测支原体对细胞的致病力变化.结果显示,当NF-κB抑制剂BAY11-7082浓度为1μmol/L、5μmol/L和10μmol/L不影响细胞活性;在24h,绵羊肺炎支原体可以显著提高NF-κBp65和IL-8 mRNA的表达水平,显著增加caspase-3的活性和H2O2分泌水平,而BAY11-7082能够显著降低IL-8mRNA的表达和caspase-3活性、胞内肺炎支原体数量;结果表明NF-κB信号通路在绵羊肺炎支原体致病机制中发挥重要作用.

TLR 4在绵羊肺炎支原体介导肺泡上皮细胞凋亡中的作用机理

为了分析TLR4在绵羊肺炎支原体介导肺泡上皮细胞凋亡中的分子机制,以绵羊肺泡上皮细胞为材料,用不同浓度的抑制剂TAK-242与细胞孵育,用MTT法检测细胞活性,用试剂盒检测Caspase-3和Caspase-8的活性,以及用实时定量PCR检测TLR4和TNF-αmRNA的表达水平,接着用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:当抑制剂TAK-242浓度为1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L不影响细胞活性,而当浓度为20 nmol/L和30 nmol/L时细胞活性显著降低(P<0.05);在感染比例(MOI)为10的情况下,在12 h和24 h支原体可以提高TLR4 mRNA的表达水平;绵羊肺炎支原体可显著提高Caspase-3和Caspase-8的活性,而TAK-242能够显著降低Caspase-3和Caspase-8的活性(P<0.01);在感染时间为24 h,支原体可以提高促TNF-αmRNA的表达水平,而抑制剂TAK-242在10 nmol/L的浓度下可以降低支原体介导的TNF-αmRNA的表达水平;在24 h支原体引起的细胞的细胞凋亡率为16.7%±1.81%,而抑制剂TAK-242处理组引起的细胞凋亡率为11.7%±1.32%。表明TLR4在绵羊肺炎支原体诱导肺泡上皮细胞凋亡中发挥重要作用。

MyD88在绵羊肺炎支原体感染过程中的作用

为分析MyD88在绵羊肺炎支原体(MO)感染肺泡上皮细胞中的分子机制。用不同浓度的抑制剂ST2825与细胞孵育24h,用MTT法检测细胞活性;MO感染细胞后,于4、8、12、24h收集细胞,利用实时定量PCR检测MyD88mRNA的表达水平。采用不同浓度的MyD88抑制剂ST2825与细胞孵育1h,然后用MO感染细胞,于24h收集细胞,利用实时定量PCR检测白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的表达水平,用试剂盒检测caspase-3活性、caspase-8活性、H2O2浓度、NO浓度和LDH浓度变化。结果显示,MO于4、8、12、24h显著提高细胞MyD88mRNA表达水平;MO显著提高细胞IL-8mRNA水平、TNF-αmRNA水平、caspase-3活性、caspase-8活性、H2O2浓度、NO浓度和LDH浓度(P<0.01),而ST2825(浓度为10μmol/L和20μmol/L)能够显著降低MO介导的以上指标(P<0.05),表明MyD88在MO感染肺泡上皮细胞过程中发挥重要作用。

规模化猪场O型口蹄疫抗体水平监测与分析

为切实猪O型口蹄疫抗体的免疫情况,科学评估免疫的质量,采用间接ELISA方法定点对17个规模猪场育肥猪108份、保育猪117份、哺乳仔猪121份、母猪60份、公猪104份(春、秋季各510份),共计1 020份猪O型口蹄疫免疫抗体血清进行检测,结果显示,春季阳性414份,平均免疫合格率为81.83%,大于农业部规定的标准(≥70.00%),免疫合格率较低的为65.00%和68.33%,未达到农业部规定的标准,不同类型猪的阳性水平春季平均阳性率74.10%,公猪阳性率94.23%,阳性率最高,其次是母猪77.78%,依次是育肥猪72.22%、保育猪70.08%、哺乳仔猪56.20%。秋季平均免疫合格率为85.00%,大于农业部规定的标准,免疫合格率最高96.67%,最低合格率70.00%,不同类型猪阳性水平,平均阳性率81.70%,母猪阳性率95.56%,阳性率最高,其次是育肥猪89.81%,然后依次是公猪88.46%、保育猪74.35%、哺乳仔猪60.33%。综合:2015年两次监测猪O型口蹄疫抗体中,春、秋季各地区猪O型口蹄疫抗体水平差异较大,大部地区免疫合格率均大于农业部规定的标准,部分地区抗体水平有待提高,哺乳仔猪的免疫水平较低。

MyD88抑制剂ST2825对丝状支原体山羊亚种感染宿主细胞的影响

为分析MyD88在丝状支原体山羊亚种(Mmc)感染肺泡上皮细胞中的分子机制。以山羊肺泡上皮细胞为材料,用不同浓度的MyD88抑制剂(ST2825)与细胞孵育,MTT法检测细胞活性,试剂盒检测caspase-3的活性,以及实时定量PCR检测MyD88和TNF-a mRNA的表达水平,试剂盒检测H_2O_2浓度和NO浓度。当ST2825浓度为5、10和20μmol·L^(-1)不影响细胞活性,而浓度为40μmol·L^(-1)时细胞活性显著降低;感染比例(MOI)为10,感染时间为8、12和24 h,Mmc可以显著提高MyD88 mRNA的表达水平(P<0.01);可显著提高caspase-3的活性,而ST2825能够显著降低caspase-3(P<0.05);感染时间为24 h,Mmc可显著提高TNF-a mRNA的表达水平、H_2O_2浓度和NO浓度(P<0.05),而ST2825在10和20μmol·L^(-1)的浓度时,可显著降低Mmc介导的caspase-3活性、H_2O_2浓度以及LDH水平(P<0.05),ST2825在5、10和20μmol·L^(-1)浓度时可显著降低TNF-a mRNA的表达水平和NO浓度(P<0.05)。

磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002对李斯特菌感染的影响

为检测磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)在小鼠脑微血管内皮细胞内存活的影响。将不同浓度抑制剂LY294002与细胞共同孵育,MTT法检测不同浓度抑制剂LY294002对细胞活性的影响,然后将L.monocytogenes分别感染细胞,利用菌落计数法计算L.monocytogenes的胞内细菌数量,检测LY294002对L.monocytogenes介导的小鼠生存曲线的影响,利用试剂盒检测抑制剂LY294002对L.monocytogenes介导的LDH和IFN-γ分泌的影响。抑制剂LY294002在5μmol/L、10μmol/L或20μmol/L浓度时不影响细胞活性,LY294002显著抑制了L.monocytogenes的胞内和脏器内细菌数量,提高L.monocytogenes介导的小鼠存活率,分别显著提高和降低L.monocytogenes介导的IFN-γ水平和LDH水平(P<0.05)。本研究表明,LY294002可调控细胞内Lm的存活,为L.monocytogenes引起脑膜炎的致病机制提供科学依据。

mTOR抑制剂对胞内李斯特菌繁殖的影响

为了检测mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)对单核细胞增生李斯特菌(Lm)在小鼠脑微血管内皮细胞内存活的影响,将不同浓度抑制剂雷帕霉素与细胞共同孵育,然后将Lm分别感染细胞,细菌菌落计数法计算胞内细菌数量,MTT法检测抑制剂雷帕霉素对细胞活性的影响,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抑制剂雷帕霉素对Lm介导的IFN-γ和IL-6分泌的影响,利用试剂盒检测caspase-1活性。结果表明:抑制剂雷帕霉素在5、10、25 nmol/L浓度时不影响细胞活性,雷帕霉素显著抑制了Lm在细胞,且与雷帕霉素浓度和感染时间相关,雷帕霉素显著提高了Lm介导的IFN-γ、IL-6、caspase-1、IL-1β和NLRP3的mRNA水平。结论:本研究表明,mTOR抑制剂雷帕霉素可调控细胞内Lm的存活,雷帕霉素可增强Lm介导的细胞炎性体水平,为Lm引起脑膜炎的致病机制提供科学依据。

羊种布氏杆菌M5-90 DnaK的原核表达及免疫保护性研究

为对布氏杆菌DnaK基因的原核表达情况及免疫保护性进行分析,根据Gen Bank中公布的羊种布氏杆菌M5-90的DnaK基因序列,设计引物,合成DnaK基因片段,将其连接到p UC57载体测序;将DnaK基因克隆至原核表达载体pET-28a,转化入大肠杆菌DE3感受态细胞中诱导表达;用SDS-PAGE凝胶电泳对DnaK融合蛋白进行分析;利用AKTAxpress智能多维纯化系统进行纯化;用Western-blot分析其反应原性。将DnaK融合蛋白免疫小鼠,利用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IgG和IFN-γ水平。结果显示,获得pET-28a-DnaK重组表达质粒,大约在69.8 ku处出现DnaK融合蛋白条带;纯化后条带单一;DnaK具有较好的反应原性;DnaK融合蛋白可诱导小鼠血清产生抗体IgG和细胞因子IFN-γ。结果表明,DnaK融合蛋白可作为候选亚单位疫苗。

布鲁氏菌BMEII0988基因的克隆、原核表达及免疫原性分析

[目的]检测布鲁氏菌BMEII0988基因的原核表达情况并对其免疫原性进行分析。[方法]以热灭活的布鲁氏菌16M标准株为模板,根据Gen Bank中公布的羊种布鲁氏菌16M的BMEII0988基因序列分别设计引物,用PCR方法扩增BMEII0988基因的编码序列,连接到T载体测序,将测序正确的基因序列克隆到原核表达载体p ET-32a上,转化入大肠杆菌DE3感受态细胞中诱导表达,将获得的目标蛋白用AKTAxpress智能多维纯化系统进行纯化,并用Western Blot分析其反应原性。[结果]BMEII0988基因长度为1 131 bp,编码377个氨基酸,SDS-PAGE表明BMEII 0988融合蛋白在大约66 k Da处出现条带,纯化后条带单一,BMEII 0988蛋白(NCBI标准序列号:WP_002966326.1)具有较好的反应原性。[结论]该研究为下一步建立相应蛋白标记的诊断方法和疫苗的研发奠定了基础。

JAK/STAT通路抑制剂AG490对单核细胞增生李斯特菌感染的影响

为检测Janus激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)信号通路抑制剂α-氰-3, 4-二羟基-N-苄基肉桂酰胺(AG490)对单核细胞增生李斯特菌(LM)感染小鼠脑微血管内皮细胞和小鼠的影响,将不同浓度抑制剂AG490与细胞共同孵育,然后将LM分别感染细胞,MTT法检测不同浓度抑制剂AG490对细胞活性的影响;利用菌落计数法计算LM的侵袭率和胞内细菌数量,检测AG490对LM介导的小鼠生存曲线的影响;利用试剂盒检测抑制剂AG490对LM介导的乳酸脱氢酶(LDH)、白细胞介素-1β(IL-1β)、干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-6(IL-6)分泌的影响;利用实时定量PCR检测AG490对LM介导的炎性小体NLRP3的mRNA水平影响。结果:抑制剂AG490在5、10或15μmol/L浓度时未见对细胞活性有明显影响,AG490显著抑制了LM的侵袭、胞内和脏器内细菌数量,提高小鼠成活率,显著提高LM介导的LDH、IFN-γ、IL-6、IL-1β和NLRP3的mRNA水平。本研究表明,JAK/STAT信号通路抑制剂AG490可调控细胞内LM的存活,增强LM介导的细胞炎性小体水平,为调查LM引起脑膜炎的致病机制提供科学依据。