莫特塞尼与EZH2抑制剂GSK126联合应用对肝癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的:探讨多激酶抑制剂莫特塞尼联合果蝇zeste基因增强子的人类同源物2 (EZH2)抑制剂GSK126对肝癌Huh7细胞体外增殖和凋亡的影响,初步阐明其相关机制。方法:不同浓度(0、1、5、10、20、40和60μmol·L^(-1))莫特塞尼处理Huh7细胞,采用CCK-8法检测各组Huh7细胞增殖率,采用Western blotting法检测不同浓度(0、2.5、5.0、10.0和20.0μmol·L^(-1))莫特塞尼组Huh7细胞中EZH2和磷酸化EZH2 (p-EZH2)蛋白表达水平。莫特塞尼和GSK126联合作用于Huh7细胞,采用CCK-8法和克隆形成实验确定后续实验合适的药物浓度。Huh7细胞分为对照组、莫特塞尼(10μmol·L^(-1))组、GSK126 (5μmol·L^(-1))组和联合组(莫特塞尼+GSK126),采用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)荧光染色法检测各组Huh7细胞增殖率,流式细胞术检测各组Huh7细胞凋亡率,Western blotting法检测各组Huh7细胞中细胞外信号调节激酶(ERK)、磷酸化ERK (p-ERK)、蛋白激酶B (AKT)和磷酸化AKT (p-AKT)蛋白表达水平。结果:CCK-8法检测,不同浓度莫特塞尼组Huh7细胞存活率随着药物浓度升高逐渐降低,与0μmol·L^(-1)莫特塞尼组比较,20、 40和60μmol·L^(-1)莫特塞尼组Huh7细胞增殖率明显降低(P<0.05或P<0.01);Western blotting法检测,与0μmol·L^(-1)莫特塞尼组比较,5.0、10.0和20.0μmol·L^(-1)莫特塞尼组Huh7细胞中EZH2和p-EZH2蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。通过CCK-8法和克隆形成实验确定10μmol·L^(-1)莫特塞尼和5μmol·L^(-1) GSK126用于后续实验。与对照组比较,莫特塞尼组、GSK126组和联合组Huh7细胞增殖率明显降低(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.05或P<0.01);与莫特塞尼组和GSK126组比较,联合组Huh7细胞增殖率明显降低(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。与对照组、莫特塞尼组和GSK126组比较,联合组Huh7细胞中p-AKT和p-ERK蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:单独应用莫特塞尼抑制肝癌Huh7细胞增殖和促进凋亡效果不明显,可能与EZH2升高导致细胞耐药有关。莫特塞尼与GSK126联合应用可通过抑制AKT和ERK信号通路,增强莫特塞尼对肝癌Huh7细胞的增殖抑制和促凋亡作用。

脱水穿心莲内酯对四氯化碳诱导的肝纤维化模型小鼠肝细胞凋亡的抑制作用及其机制

目的:探讨脱水穿心莲内酯(DA)对四氯化碳(CCl 4)诱导的肝纤维化模型小鼠肝细胞凋亡的抑制作用,并阐明其可能的作用机制。方法: 30只6~8周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组、模型组和治疗组,每组10只。除正常对照组外其余2组小鼠采用20%CCl 4 2.0 mL·kg^-1 腹腔注射,每周3次,制备肝纤维化模型,对照组小鼠给予等量的橄榄油。治疗组小鼠按100 mg·kg^-1 DA灌胃给药,每周3次,对照组和模型组小鼠灌服等体积生理盐水。给药4周,末次给药后24 h摘眼球取血,断髓,取肝脏。检测各组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性;检测各组小鼠肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平;HE染色和天狼猩红染色观察各组小鼠肝脏病理学表现;Western blotting法检测各组小鼠肝组织中8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶1(Ogg1)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)蛋白水平;免疫组织化学法检测各组小鼠肝组织中转化生长因子β1(TGF-β1)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平。结果:与对照组比较,模型组小鼠血清中ALT和AST活性及肝组织中MDA水平均明显升高( P <0.05),肝组织中SOD活性明显下降( P <0.05);与模型组比较,治疗组小鼠血清中ALT和AST活性及肝组织中MDA水平明显降低( P <0.05),肝组织中SOD活性明显升高( P <0.05)。HE染色和天狼猩红染色,与模型组比较,治疗组小鼠肝组织中炎性细胞浸润和胶原沉积程度明显改善。与对照组比较,模型组小鼠肝组织中Ogg1、Caspase-3、Bax、TGF-β1、α-SMA和Bcl-2蛋白表达水平明显升高( P <0.05);与模型组比较,治疗组小鼠肝组织中Ogg1、Caspase-3、Bax、TGF-β1和α-SMA蛋白表达水平明显降低( P <0.05),Bcl-2蛋白表达水平明显升高( P <0.05)。结论: DA对CCl 4导致的肝纤维化小鼠具有保护作用,其机制可能与降低氧化应激损伤、抑制肝细胞凋亡和减少肝星状细胞活化有关。

外分泌葡萄糖调节蛋白78对肝细胞癌侵袭的影响

目的观察肝细胞癌细胞外分泌葡萄糖调节蛋白78(GRP78)对肝细胞癌侵袭的影响。方法应用重组GRP78处理肝细胞癌细胞(SMMC7721和PLC5),采用Transwell方法检测肝细胞癌细胞侵袭,共聚焦显微镜技术观察侵袭伪足的形成情况,免疫印迹技术检测Cortactin、FAK和Src表达及磷酸化水平。结果重组GRP78可以促进肝细胞癌细胞侵袭,促进侵袭伪足形成和Cortactin、FAK、Src磷酸化,应用表皮生长因子受体(EGFR)抗体阻断可以抑制重组GRP78对肝细胞癌细胞侵袭的促进作用。结论肝细胞癌细胞外分泌GRP78可以促进肝细胞癌侵袭,EGFR在该过程中可能发挥重要作用。

姜油酮联合索拉非尼对人肝癌HepG2细胞迁移和侵袭的抑制作用

目的:探讨姜油酮联合索拉非尼对人肝癌HepG2细胞迁移和侵袭的影响,并阐明其相关作用机制。方法:采用不同浓度姜油酮和索拉非尼单独或联合对人肝癌HepG2细胞进行干预,MTT法检测细胞增殖率,根据其结果选择姜油酮和索拉非尼的适合浓度。实验分为对照组(DMSO)、姜油酮组(30μmol·L^(-1))、索拉非尼组(3μmol·L^(-1))和联合组(姜油酮30μmol·L^(-1)+索拉非尼3μmol·L^(-1)),采用细胞划痕实验检测各组HepG2细胞划痕愈合率,Transwell实验检测各组HepG2细胞穿膜细胞数,Western blotting法检测各组HepG2细胞中基质金属蛋白酶2 (MMP-2)和基质金属蛋白酶9 (MMP-9)蛋白表达水平。结果:MTT实验,与对照组比较,姜油酮组和联合组细胞增殖率明显降低(P<0.01)。细胞划痕实验,与对照组比较,姜油酮组和索拉非尼组HepG2细胞划痕愈合率降低(P<0.05);与姜油酮组和索拉非尼组比较,联合组HepG2细胞划痕愈合率明显降低(P<0.01)。Transwell实验,与对照组比较,姜油酮组和索拉非尼组HepG2细胞穿膜细胞数减少(P<0.05);与姜油酮组和索拉非尼组比较,联合组穿膜细胞数明显降低(P<0.01)。Western blotting法检测,与对照组比较,姜油酮组和索拉非尼组HepG2细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平降低(P<0.05);与姜油酮组和索拉非尼组比较,联合组HepG2细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:姜油酮可通过降低HepG2细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达来抑制人肝癌细胞迁移和侵袭能力,且与索拉非尼联用效果更佳。

MST1R抑制剂BMS-777607对乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制和凋亡诱导作用

目的:探讨巨噬细胞刺激1受体(MST1R)抑制剂BMS-777607对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响,并阐明其作用机制。方法:采用不同浓度BMS-777607处理乳腺癌MCF-7细胞,将细胞分为对照组(0μmol·L-1 BMS-777607组)和0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0及20.0μmol·L-1 BMS-777607组。采用MTT法检测各组MCF-7细胞增殖率,克隆形成实验检测各组MCF-7细胞存活率,EDU成像和EDU流式细胞术检测各组MCF-7细胞增殖率,Hoechst33342染色法检测各组MCF-7细胞凋亡形态表现,流式细胞术检测各组MCF-7细胞凋亡率,Western blotting法检测各组MCF-7细胞中ERK、p-ERK、Akt、p-Akt、PARP、Cleaved PARP、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Caspase-9和Cleaved Caspase-9蛋白表达水平。结果:MTT检测,与对照组比较,5和10μmol·L-1BMS-777607组MCF-7细胞增殖率升高(P<0.05或P<0.01)。克隆形成实验,与对照组比较,5和20μmol·L-1BMS-777607组MCF-7细胞存活率升高(P<0.05或P<0.01)。EDU掺入法检测,与对照组比较,10和20μmol·L-1BMS-777607组MCF-7细胞增殖率升高(P<0.05或P<0.01)。Hoechst33342荧光染色,对照组MCF-7细胞核淡染,10μmol·L-1BMS-777607组MCF-7细胞核少部分浓染、明亮,20μmol·L-1BMS-777607组MCF-7细胞核大部分浓染,细胞核染色质固缩、明亮。双染流式细胞术检测,与对照组比较,10和20μmol·L-1BMS-777607组MCF-7细胞凋亡率降低(P<0.05)。Western blotting法检测,与对照组比较,10、15和20μmol·L-1BMS-777607组MCF-7细胞中p-ERK和p-Akt蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01),PARP、Cleaved PARP、Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论:MST1R抑制剂BMS-777607能够抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制与抑制p-ERK和p-Akt表达和促进Cleaved PARP、Bax、Cleaved Caspase-9及Cleaved Caspase-3表达有关。

基于医学生科研创新能力培养的第二课堂实践研究

如何通过课程学习培养医学生的科研思维能力是每一位医学教育工作者应该思考的问题。文章通过开设程序化的医学细胞生物学第二课堂科研活动,探索适合医学生科研创新能力培养的教学方法,为高校教师开展基于科研创新能力培养的第二课堂建设与实践提供参考。

巨噬细胞刺激1受体抑制剂BMS777607对肺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨巨噬细胞刺激1受体(MST1R)抑制剂BMS777607对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响,阐明其可能的机制。方法:选择人肺癌A549细胞,不同浓度(1、5、10、15和20μmol·L^-1)BMS777607处理细胞48 h,同时设对照组,采用MTT法检测各组细胞增殖率;不同浓度(1、5、10、15和20μmol·L^-1)BMS777607处理A549细胞14 d,同时设对照组,采用克隆形成实验观察各组细胞克隆形成情况并检测各组细胞增殖率;不同浓度(10和20μmol·L^-1)BMS777607处理A549细胞24 h,同时设对照组,采用EdU掺入法检测各组细胞中EdU阳性细胞率;不同浓度(1、5、10、15和20μmol·L^-1)BMS777607处理A549细胞48 h,同时设对照组,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率;应用Western blotting法检测各组细胞中蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)、聚酰苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、活化型PARP(Cleaved-PARP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Caspase 9)和活化型Caspase 9(Cleaved-Caspase 9)蛋白表达水平。结果:MTT实验,与对照组比较,不同浓度BMS777607组细胞增殖率明显降低(P<0.05或P<0.01),且呈浓度和时间依赖性。克隆形成实验,与对照组比较,10μmol·L^-1 BMS777607组细胞克隆形成数量明显减少,20μmol·L^-1 BMS777607组细胞几乎无克隆形成;与对照组比较,不同浓度BMS777607组细胞增殖率明显降低(P<0.05或P<0.01)。EdU掺入法实验,与对照组比较,10和20μmol·L^-1 BMS777607组细胞中EdU阳性细胞率均明显降低(P<0.05或P<0.01)。双染流式细胞术检测,与对照组比较,10、15和20μmol·L^-1 BMS777607组A549细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。Western blotting法检测,与对照组比较,不同浓度BMS777607组细胞中p-AKT和p-ERK蛋白表达水平明显降低(P<0.05),Cleaved-PARP和Cleaved-Caspase 9蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:MST1R抑制剂BMS777607能够抑制肺癌A549细胞的增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与其抑制p-AKT、p-ERK表达和促进PARP、Caspase 9表达有关。

葡萄糖调节蛋白78对肝癌细胞放射敏感性的调控作用及其机制

目的:探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)对肝癌细胞放射敏感性的影响,初步阐明其分子机制。方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测肝癌SMMC-7721、HepG2、PLC、Huh7和QGY-7703细胞中GRP78 mRNA和蛋白表达水平,筛选GRP78高表达和低表达的肝癌细胞作为研究对象。采用RNA干扰技术在GRP78高表达的人肝癌SMMC-7721细胞中靶向沉默GRP78,命名为siGRP78-SMMC-7721(siGRP78组),以siNC-SMMC-7721为对照组(siNC组);采用基因重组技术在GRP78低表达的人肝癌HepG2细胞中过表达GRP78,命名为Flag-GRP78-HepG2(Flag-GRP78组),以空载体3×Flag-HepG2为对照组(3×Flag组)。各组细胞分别给予0、2、4、6、8和10 Gy剂量X射线照射后,采用MTT法检测肝癌细胞存活率,5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)荧光染色法检测肝癌细胞增殖率,Western blotting法检测肝癌细胞中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路中磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达水平。结果:RT-qPCR法和Western blotting法检测,SMMC-7721细胞中GRP78 mRNA和蛋白表达水平最高,HepG2细胞中GRP78 mRNA和蛋白表达水平最低,选取SMMC-7721和HepG2细胞作为研究对象。MTT法检测,随着放射剂量的增加,肝癌细胞存活率逐渐降低;与siNC组比较,6 Gy以上剂量X射线照射后,siGRP78组细胞存活率明显降低(P<0.01);与3×Flag组比较,4 Gy以上剂量X射线照射后,Flag-GRP78组细胞存活率明显升高(P<0.05或P<0.01)。EdU荧光染色法检测,与siNC组比较,siGRP78组细胞增殖率明显降低(P<0.05);与3×Flag组比较,Flag-GRP78组细胞增殖率明显升高(P<0.05)。Western blotting法检测,与siNC组比较,siGRP78组细胞中p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与3×Flag组比较,Flag-GRP78组细胞中p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:高表达水平的GRP78可降低肝癌细胞放射敏感性,其作用机制可能与GRP78激活PI3K/Akt信号通路有关。

EZH2抑制剂GSK126对肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨zeste基因增强子同源物2(EZH2)特异性抑制剂GSK2816126(GSK126)对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响,阐明其可能机制。方法:常规体外培养A549细胞,将细胞分为对照组和不同浓度(1.0、2.5、5.0、10.0和15.0μmol·L-1)GSK126组。MTT比色法检测各组细胞存活率,克隆形成实验检测各组细胞集落形成数并计算克隆形成率,EdU细胞增殖成像法检测各组细胞增殖率,Hoechst-33342荧光染色法观察各组细胞凋亡形态表现,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、B细胞淋巴瘤-2原癌基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)和活化型天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-Caspase-3)蛋白表达水平。结果:MTT比色法,与对照组比较,随着GSK126浓度升高,不同浓度GSK126组细胞存活率明显降低(P<0.05);克隆形成实验,与对照组比较,随着GSK126浓度升高,不同浓度GSK126组克隆形成率逐渐降低(P<0.05);EdU成像,与对照组比较,随着GSK126浓度升高,不同浓度GSK126组增殖率明显降低(P<0.01);Hoechst-33342染色,与对照组比较,随着GSK126浓度的升高,5、10和15μmol·L-1 GSK126组凋亡细胞数明显增加;流式细胞术检测,与对照组比较,随着GSK126浓度升高,不同浓度GSK126组细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。Western blotting法,与对照组比较,随着GSK126浓度升高,不同浓度GSK126组细胞中p-AKT和Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05),Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平逐渐升高(P<0.05)。结论:GSK126可能通过降低AKT磷酸化水平抑制细胞增殖,并且通过诱导Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路活化,激活凋亡途径,促进肺癌细胞凋亡。

抗体封闭细胞表面GRP78抑制厄洛替尼耐药性口腔舌鳞状细胞癌细胞的生长和转移

目的观察应用特异性抗体封闭细胞表面葡萄糖调节蛋白78(GRP78)对厄洛替尼耐药的口腔舌鳞状细胞癌(简称鳞癌)细胞生长的抑制作用。方法应用GRP78特异性抗体处理厄洛替尼耐药性舌鳞癌细胞(TCA-8113-ER),采用MTT方法和克隆形成实验检测抗体封闭对TCA-8113-ER细胞增殖情况及其对厄洛替尼反应性的影响,in-cell Western技术检测GRP78在TCA-8113-ER细胞表面的表达,流式细胞术检测TCA-8113-ER细胞凋亡情况,划痕法和Transwell法检测TCA-8113-ER细胞侵袭和转移情况,Western blotting检测c-MET、AKT和STAT3表达及磷酸化水平。结果GRP78特异性抗体可以抑制TCA-8113-ER细胞的生长,促进其凋亡,增强其对厄洛替尼的反应性,抑制其侵袭和转移,抑制c-MET、AKT和STAT3的磷酸化。结论抗体封闭细胞表面GRP78能够抑制厄洛替尼耐药性舌鳞癌细胞的生长、侵袭和转移,增加其对厄洛替尼的敏感性。

葡萄糖调节蛋白78对L858R突变的非小细胞肺癌erlotinib敏感性的影响

目的观察葡萄糖调节蛋白78(GRP78)对L858R突变非小细胞肺癌对erlotinib敏感性的影响。方法应用基因转染技术干预H3255细胞中GRP78及其突变体的表达,应用MTT方法检测erlotinib对细胞增殖的抑制情况,应用流式细胞术和FITCTUNEL分析凋亡情况,应用免疫印迹技术检测表皮生长因子受体(EGFR)、细胞外信号调节激酶(ERK)的表达及磷酸化水平。结果过表达GRP78及其多肽结合结构域删除的突变体降低H3255细胞对erlotinib的敏感性,抑制erlotinib诱导的细胞凋亡,促进EGFR、ERK的磷酸化。结论 GRP78通过其ATPase结构域促进非小细胞肺癌细胞对erlotinib耐药。

指环蛋白31对表皮生长因子受体表达的调控作用及其机制

目的:探讨指环蛋白31(RNF31)对表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响,并分析RNF31对EGFR的调控机制。方法:采用免疫共沉淀(Co-IP)法验证RNF31蛋白与EGFR蛋白的相互作用。HEK293T细胞分为空载体组(转染pcDNA3.1空载体)和RNF31组(转染RNF31-Flag质粒),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测细胞中EGFR mRNA和蛋白表达水平。RNF31的泛素连接酶功能位点(RNF31C699/702S)和去泛素化酶结合位点(RNF31N84A Y93A)突变后,采用Western blotting法检测各组细胞中EGFR蛋白表达水平。HEK293细胞分为空载体组、RNF31组(转染RNF31-Flag质粒)、RNF31+EGFR抑制剂吉非替尼(Gefitinib)组和RNF31+EGFR抑制剂厄洛替尼(Erlotinib)组,采用Western blotting法检测各组细胞中EGFR及其下游信号通路蛋白表达水平。结果:Co-IP法检测,RNF31蛋白与EGFR蛋白存在相互作用。与空载体组比较,RNF31组细胞中EGFR mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。与空载体组比较,转染RNF31C699/702S组和野生型RNF31组细胞中EGFR蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与RNF31组比较,转染RNF31N84A Y93A组细胞中EGFR蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与空载体组比较,RNF31组细胞中EGFR及其下游信号通路中核因子κB(NF-κB)、磷酸化信号传导与转录激活因子3(p-STAT3)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷酸化MAPK(p-MAPK)蛋白表达水平明显升高(P<0.05),RNF31+Gefitinib组和RNF31+Erlotinib组细胞中蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、STAT3和MAPK蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:RNF31通过去泛素化酶结合结构域发挥去泛素化的作用,降低EGFR蛋白分子表面的泛素化水平,使EGFR蛋白降解速率减慢,同时高表达的EGFR可以激活其下游与细胞增殖和分裂相关蛋白的表达。

维生素D受体激活对小鼠胆管结扎所致肝纤维化的影响及其机制

目的:探讨维生素D受体(VDR)激活对胆总管结扎(BDL)诱导小鼠肝纤维化的保护作用,并阐明其作用机制。方法:将60只C57BL/6小鼠随机分为假手术组、假手术后给药组、模型组和治疗组,每组15只。假手术组小鼠开腹但不结扎胆总管,模型组小鼠双线结扎胆总管并中间离断,假手术后给药组和治疗组小鼠手术前3 d腹腔注射VDR激动剂帕立骨化醇(200 ng·kg-1,每周3次),术后继续给药5 d。术后第5天取小鼠肝脏,采用HE染色和天狼猩红染色观察小鼠肝组织病理形态表现和肝纤维化程度。二氢乙啶(DHE)染色检测小鼠肝组织活性氧(ROS)水平。Western blotting法检测小鼠肝组织中沉默交配型信息调节3(Sirt3)、8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(OGG1)、α-平滑肌蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)表达水平。结果:HE染色,假手术组和假手术后给药组小鼠肝细胞形态结构完整,无炎性细胞浸润;模型组小鼠组织中出现大量浸润的炎性细胞、点状样灶状坏死区,在肝小叶之间出现条索状的胶原沉积;与模型组比较,治疗组小鼠肝组织坏死灶面积明显缩小,炎症细胞浸润明显改善。天狼猩红染色,假手术组和假手术后给药组小鼠肝组织中仅大胆管周围存在少量的纤维化;模型组小鼠肝组织汇管区胶原沉积明显;与模型组比较,治疗组小鼠肝组织中胆管周围胶原沉积减少。DHE染色,假手术组和假手术后给药组小鼠肝组织中,仅在汇管区存在少量的红色荧光;模型组小鼠肝组织中,汇管区及大胆管周围呈现出明显增多的红色荧光;与模型组比较,治疗组小鼠红色荧光的强度降低。Western blotting法检测,与假手术组和假手术后给药组比较,模型组小鼠肝组织中Sirt3蛋白表达水平明显降低(P<0.05),OGG1、α-SMA和ColⅠ蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,治疗组小鼠肝组织中Sirt3蛋白表达水平明显升高(P<0.05),OGG1、α-SMA和ColⅠ蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:VDR激活通过上调Sirt3蛋白降低氧化应激导致的肝星状细胞(HSC)激活,缓解胆汁淤积性肝纤维化。

骨化三醇对胆管结扎所致小鼠肝纤维化的保护作用及其机制

目的:探讨骨化三醇对胆总管结扎(BDL)诱导的小鼠肝纤维化的保护作用,并阐述其可能的作用机制。方法:选用45只8~10周雄性C57BL/6小鼠,随机分为假手术组、肝纤维化模型组(模型组)和骨化三醇治疗组(治疗组),每组15只。假手术组小鼠绕胆总管穿过手术线,不结扎。模型组小鼠双重结扎胆总管并离断。治疗组小鼠术后2.5μg·kg~(-1)腹腔注射骨化三醇,每周3次。假手术组和模型组小鼠注射等体积生理盐水。术后继续给药4周,第28天眼眶取血,取小鼠肝脏。术后第2天检测各组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性及总胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBIL)和羟脯氨酸(Hyp)水平。苏木精-伊红(HE)染色和天狼猩红染色观察各组小鼠肝组织病理形态学和肝组织纤维化程度。Western blotting法检测各组小鼠肝组织中维生素D受体(VDR)细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(p-ERK)、α-平滑肌蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1 (TGF-β1)、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和结蛋白(Desmin)表达水平。免疫组织化学法检测各组小鼠肝组织中α-SMA和TGF-β1蛋白表达情况。结结果果:与假手术组比较,模型组小鼠血清中ALT和AST活性及TBA、TBIL和Hyp水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,治疗组小鼠血清中ALT和AST活性及TBA、TBIL和Hyp水平明显降低(P<0.05)。HE染色,假手术组小鼠肝小叶正常,组织结构较为完整,未见炎性细胞浸润;模型组小鼠肝组织出现炎性细胞浸润,坏死灶和胶原沉积较为明显;与模型组比较,治疗组小鼠肝组织坏死灶区域明显减少,炎性浸润有所改善。天狼猩红染色,假手术组小鼠肝组织仅有少量胶原沉积出现在中央静脉周围;模型组小鼠肝组织中央静脉及汇管区出现明显胶原沉积;与模型组比较,治疗组胶原沉积明显减少。Western blotting法检测,与假手术组比较,模型组小鼠肝组织中ERK、p-ERK、α-SMA、TGF-β1、 ColⅠ和Desmin蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,治疗组小鼠肝组织中ERK、 pERK、α-SMA、TGF-β1、ColⅠ和Desmin蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。免疫组织化学,模型组小鼠肝组织中α-SMA和TGF-β1蛋白表达量高于假手术组;治疗组小鼠肝组织中α-SMA和TGF-β1蛋白表达量明显低于模型组。结论:骨化三醇通过激活维VDR,下调ERK蛋白表达,降低TGF-β1表达,减少肝星状细胞(HSCs)激活,抑制胶原在组织间沉积,从而缓解BDL诱导的小鼠肝纤维化。

硫酸镁对大鼠局灶性脑缺血后氧化应激和NF-кB蛋白表达的影响

目的探讨硫酸镁(MgSO_4)对大鼠脑缺血后氧化应激和NF-кB蛋白表达的影响。方法 60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组及MgSO_430 mg/kg、60 mg/kg和120 mg/kg组。采用线栓法制备大鼠永久性大脑中动脉缺血模型(MCAO)。术后即刻假手术组与模型组腹腔注射生理盐水1 ml,MgSO_4各剂量组按上述剂量腹腔注射250 g/L MgSO_4注射液(均用生理盐水稀释至1 ml)。24 h后检测脑匀浆液中超氧化物岐化酶活性(SOD)、丙二醛(MDA)含量,应用免疫组化技术观察NF-кB蛋白阳性细胞的表达。结果与模型组相比,MgSO_460 mg/kg和MgSO_4120 mg/kg两组的SOD活性均显著增高(P=0.000),而MgSO_430 mg/kg组没有统计学意义;MgSO_4各剂量组的MDA含量均显著降低(P=0.000);MgSO_460 mg/kg组和MgSO_4120 mg/kg组的NF-кB蛋白阳性细胞表达明显减少(P=0.000),而MgSO_430 mg/kg组无统计学差异。与MgSO_430 mg/kg组比较,MgSO_4120 mg/kg组的SOD活性显著增高(P=0.015),而MgSO_460 mg/kg组没有统计学意义;MgSO_460 mg/kg组和MgSO_4120 mg/kg组的MDA含量显著降低(P=0.001和P=0.000);MgSO_460 mg/kg组和MgSO_4120 mg/kg两组的NF-кB蛋白阳性细胞表达明显减少,差异具有显著性(P=0.000)。结论 MgSO_4对大鼠局灶性脑缺血后氧化应激损伤具有良好的保护作用,其机制可能与清除自由基、减轻氧化性损伤和抑制NF-кB蛋白的表达有关。

虫草素对人胃癌细胞系HGC-27的影响及分子机制

目的探讨虫草素对HGC-27细胞增殖、运动性和凋亡的影响及相关机制。方法用不同浓度虫草素处理人胃癌细胞系HGC-27、AGS和MGC-803,利用CCK-8法检测细胞活力,集落形成试验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,体外划痕试验检测细胞运动性。Western blot检测Bcl-2、Bax、ERK、磷酸化ERK(p-ERK)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)蛋白表达水平。结果与对照组相比,虫草素处理组明显抑制细胞增殖、集落形成率、细胞运动性并诱导细胞凋亡,下调Bcl-2、GSK-3β和p-ERK蛋白表达水平,且呈浓度和时间依赖性,但对Bax蛋白表达水平没有影响。结论虫草素通过调节ERK/GSK-3β信号通路起到抗肿瘤作用,有望成为临床干预和治疗胃癌的潜在药物。