敲低KHDRBS3基因抑制人卵巢癌CAOV-3细胞增殖

目的探讨含KH RNA结合结构域信号转导相关分子3(KHDRBS3)基因对体外培养的人卵巢癌CAOV-3细胞增殖的影响。方法取对数生长期细胞,分为未转染组、无关小干涉RNA(siRNA)序列转染组、KHDRBS3-siRNA转染组。采用反转录PCR及Western blot法验证KHDRBS3基因的沉默效果;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法比较不同组别CAOV-3细胞增殖情况;采用流式细胞术检测不同处理组CAOV-3细胞的细胞周期分布。结果 KHDRBS3-siRNA转染后可明显降低CAOV-3细胞KHDRBS3的mRNA和蛋白水平,敲低CAOV-3细胞KHDRBS3水平后,细胞的增殖能力明显降低,G0/G1期细胞比例增加、S期细胞比例降低、G2/M期细胞比例无明显变化。结论敲低KHDRBS3的水平可使CAOV-3细胞发生G0/G1期阻滞,抑制细胞增殖。

实验性自身反应性脑脊髓炎中β-连环蛋白对IL-17的影响

目的探讨β-catenin(β-连环蛋白)在实验性自身反应性脑脊髓炎(EAE)模型中对IL-17的影响,揭示β-catenin在多发性硬化症中的作用机制。方法将32只C57BL/6小鼠分为EAE对照组(n=16)和EAE+β-catenin激动剂组(n=16);从免疫第0天起,激动剂组以60 mg·kg^(-1)·d^(-1)的剂量腹腔注射LiCl,共处理了30 d,观察EAE发病过程,比较临床评分、平均发病时间、临床最高分。用ELISA检测法观察脊髓中炎症相关细胞因子(IL-17、IL-6);用实时定量PCR(Real-Time PCR)法和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测脊髓中的β-catenin以及调节因子(TCF4、RORγt)的mRNA表达。结果与EAE组相比,EAE+β-catenin激动剂组发病时间延后(P<0.05)、平均临床评分降低(P<0.05)、最高临床评分降低(P<0.05)。EAE+β-catenin激动剂组IL-17、IL-6含量比EAE组明显降低(P<0.05);EAE+β-catenin激动剂组脊髓中RORγt表达比EAE组明显降低(P<0.05),TCF4表达增加(P<0.05)。结论在EAE发病过程中,β-catenin激动剂可通过上调TCF4调节RORγt和IL-17和IL-6,延缓EAE的发病过程。

应用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Pkmyt1相互作用的候选分子

目的蛋白激酶Pkmyt1负调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的进程,但具体调控机制还不清楚。因此,利用酵母双杂交系统从人卵巢c DNA文库中筛选与Pkmyt1相互作用的候选蛋白,为研究Pkmyt1调控小鼠受精卵早期发育提供新线索。方法以小鼠卵巢组织c DNA为模板,构建p GBKT7-Pkmyt1诱饵质粒,转化酵母感受态细胞后,分别接种于SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp/X-α-Gal(SDO/X)和SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A plates(SDO/X/A)培养板,检测其对酵母的毒性和自身激活能力,Western blotting法检测p GBKT7-Pkmyt1在酵母细胞中的表达。将人卵巢c DNA文库与含有p GBKT7-Pkmyt1的酵母感受态细胞融合,PCR筛选出阳性克隆,提取质粒,测序鉴定,再次检测其对酵母自激活能力,利用生物信息学分析筛选蛋白与胚胎发育的关系。结果酶切鉴定和Blast分析表明p GBKT7-Pkmyt1质粒构建成功。将该质粒转入Y2H golden中,在SDO板上克隆均匀生长,在SDO/X/A平皿上无克隆生长,Western blotting检测Pkmyt1在酵母细胞中有表达。PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。通过初步筛选得到182种能够与Pkmyt1相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证有46个与Pkmyt1之间存在相互作用的蛋白。结论通过筛选发现46个蛋白可能通过与Pkmyt1相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。