腺病毒载体重组新型冠状病毒疫苗通用体外生物学活性检测方法的建立及验证

目的建立通用、稳定的腺病毒载体重组新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome 2,SARS-CoV-2)疫苗的体外生物学活性检测方法,并对其进行方法学验证。方法利用实验室之前筛选出的ELISA试剂盒筛选不同的细胞、细胞浓度和感染剂量,从而建立通用体外生物学活性检测方法并进行相对准确度、中间精密度、线性和范围的验证。结果建立了通用体外生物学活性检测方法,筛选出HEK293细胞为适宜感染用细胞,其铺板细胞浓度为8×10^(5)个/mL,细胞感染剂量是1.0×10^(7) VP。该方法经不同人员和日期检测验证,每个效价水平的相对偏倚应均在±30%内,水平效价测定值的几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)≤30%,疫苗效价理论值(对数)与其相应的效价测定值(对数)作图并进行线性回归计算,直线回归方程的相关系数r≥0.95,效价水平范围在50%~200%,证明能满足对多种SARS-CoV-2变异株腺病毒载体疫苗的检定需要。结论建立了通用、稳定的腺病毒载体SARS-CoV-2疫苗体外生物学活性检测方法,该方法可应用于腺病毒载体SARS-CoV-2疫苗的质量控制。

重组戊型肝炎疫苗菌种库的建立及其稳定性

目的建立重组戊型肝炎疫苗工程菌三级种子库,并分析其稳定性。方法将工程菌株HEV179/BL21(DE3)复苏活化,经全面检测合格后冻干保存即为原始种子库;原始种子库传代扩增,经全面检定合格后,冻干保存即为主种子库;主种子库经传代扩增和全面检定合格后,甘油冻存即为工作种子库。对三级种子库进行全面检定,并对工程菌进行冻干及甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性检测。结果建立的三级种子库经全面检定合格;菌种冻干稳定性、甘油冻存稳定性、甘油冻存时间稳定性及质粒稳定性指标均合格,菌种生长特性、遗传和表达稳定性均未发生变化。结论成功建立了HEV179/BL21(DE3)工程菌三级种子库,菌种稳定性良好,适用于重组戊型肝炎疫苗的工业化生产。

重组汉坦病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达重组汉滩型病毒（Hantaanvirus，HTNV）核蛋白（recombinant HTNV nuclear protein，rHTNNP）和重组汉城型病毒（Seoulvirus，SEOV）核蛋白（recombinant SEOV nuclear protein，rSEONP），并进行纯化。方法从HTNVPS-6株和SEOVL-99株灭活病毒液中提取总RNA，依据病毒S片段多变区基因序列两端保守序列设计引物，用逆转录PCR法扩增此S基因片段，构建原核表达质粒pET-Trx-his—HTNNP和pET-Trx-his—SEONP，并在大肠埃希菌中诱导表达。表达产物经凝胶电泳初步鉴定和镍柱亲和层析纯化后，用双向免疫扩散试验检测其抗原特异性。结果重组表达质粒经菌落PCR分析和测序证明构建正确。表达的rHTNNP和rSEONP相对分子质量约为26000，表达量分别约占菌体总蛋白的30％和20％，主要以可溶性形式表达，且纯度可达约70％。双向免疫扩散试验证实，这2种重组蛋白具有较好的抗原性。结论成功构建了表达rHTNNP和rSEONP的原核表达质粒，并获得了较高纯度的rHTNNP和rSEONP，为汉坦病毒型别鉴定试剂盒的开发奠定了基础。

人胰岛素样生长因子-1的融合表达及纯化

目的利用原核表达系统融合表达人胰岛素样生长因子-1(human insulin-like growth factor-1,hIGF-1),并进行纯化及鉴定。方法根据大肠埃希菌密码子偏好性对hIGF-1天然基因序列进行同义突变,并人工合成,PCR扩增后,克隆至pET48b(+)载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的融合蛋白Trx A-hIGF-1经Ni2+亲和层析进行纯化,纯化产物经肠激酶酶切后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET48b-Trx A-hIGF-1经菌落PCR及测序证实构建正确;表达融合蛋白相对分子质量约为26 000,表达量约为菌体总蛋白的40%,主要以可溶形式存在于菌体裂解上清中,可溶性蛋白占总目的蛋白的比例不低于90%,纯化后纯度不低于90%,蛋白浓度为0.5 mg/ml;纯化的Trx A-hIGF-1融合蛋白可被肠激酶切割为相对分子质量约为8 000的hIGF-1蛋白和18 000的Trx A蛋白,hIGF-1蛋白可与兔抗hIGF-1多克隆抗体特异性结合。结论成功表达了hIGF-1融合蛋白,为其生物学活性的研究及规模化生产奠定了基础。

重组戊型肝炎病毒P179-海藻酸钠/壳聚糖微球混悬制剂的制备及其免疫效果

目的 制备吸附重组戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)P179抗原的海藻酸钠/壳聚糖微球混悬制剂,并观察其免疫效果。方法 乳化法制备海藻酸钠/壳聚糖微球,采用不同海藻酸钠浓度、混合乳化剂添加量、混合乳化剂亲水亲油平衡值设计正交试验,确定最佳制备工艺参数。将重组HEV P179抗原吸附在最佳工艺制备的微球表面,制备吸附重组HEV P179的海藻酸钠/壳聚糖微球混悬制剂,皮下多点免疫BALB/c小鼠,测定其诱导小鼠产生特异性IgG抗体的能力,与同剂量含弗氏佐剂的重组HEV P179免疫制剂对比。结果 经正交试验确定乳化最佳工艺参数为:海藻酸钠质量分数1%、混合乳化剂体积分数2%,混合乳化剂亲水亲油平衡值4。制备的微球平均粒径为6.73 μm(分布范围3.90~9.10 μm,方差1.78 μm),形态较为均一,透射电镜观察结果与双层球体及内部疏松多孔的微球结构特点相符。用此条件制备抗原质量浓度为500 μg/ml的混悬制剂,微球对抗原的吸附率为90.64%。免疫效果观察试验结果表明,皮下多点免疫试验中微球制剂诱导特异性IgG抗体的能力优于含弗氏佐剂抗原。结论 成功制备了吸附重组HEV P179的海藻酸钠/壳聚糖微球混悬制剂,且诱导产生特异性IgG抗体的能力优于含弗氏佐剂抗原,为其在新型实验动物超敏制剂中的应用奠定了基础。