重组人白细胞介素-1受体拮抗剂制剂和沉淀中相关蛋白化学修饰类型的鉴定

目的 鉴定重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(recombinant human interleukin-1 receptor antagonist,rhIL-1Ra)制剂和室温加速获得的制剂沉淀中相关蛋白的化学修饰类型。方法 利用反相高效液相色谱(reverse phase-high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)对rhIL-1Ra制剂和室温加速获得的制剂沉淀进行相关蛋白检测,并按面积归一化法确定相关蛋白的百分比;再用液质联用质谱法对rhIL-1Ra制剂和室温加速获得的制剂沉淀进行相关蛋白的鉴定。结果 RP-HPLC结果显示,rhIL-1Ra制剂中有6个相关蛋白色谱峰,所占百分比依次为0.414%、0.870%、0.871%、0.304%、0.104%、1.182%,rhIL-1Ra室温加速获得的沉淀中有5个相关蛋白色谱峰,所占百分比依次为0.350%、3.603%、1.118%、0.629%、0.866%。液质联用结果显示,rhIL-1Ra制剂6个相关蛋白色谱峰化学修饰类型分别为甲硫氨酸氧化、天冬氨酸脱水环化+甲硫氨酸氧化、甲硫氨酸氧化、甲硫氨酸氧化、天冬氨酸脱水环化、天冬氨酸脱水环化;rhIL-1Ra室温加速获得的沉淀中5个相关蛋白色谱峰化学修饰类型分别为甲硫氨酸氧化、天冬氨酸脱水环化+甲硫氨酸氧化、以甲硫氨酸氧化为主、以天冬氨酸脱水环化+甲硫氨酸氧化为主、以天冬氨酸脱水环化为主。结论 rhIL-1Ra制剂和室温加速获得的制剂沉淀的相关蛋白修饰类型相同,主要存在3种:甲硫氨酸氧化修饰、天冬氨酸脱水环化、天冬氨酸脱水环化+甲硫氨酸氧化,本研究为提高rhIL-1Ra制剂的质量提供了参考。

重组人生长激素-Fc免疫融合蛋白多聚体含量尺寸排阻高效液相色谱检测方法的优化及验证

目的 优化重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)-Fc免疫融合蛋白多聚体含量尺寸排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测方法,并对优化的方法 进行验证。方法 利用SEC-HPLC法对rhGH-Fc免疫融合蛋白中多聚体含量进行检测,优化检测条件(盐浓度、流动相pH、流速、柱温及色谱柱型号),观察目的 蛋白与聚合体分离的效果。对方法 的系统适应性、专属性、线性与范围、精密性、准确性及定量限进行验证。结果 优化后的方法 为采用TSK-gel G2000SW_(xl)色谱柱(5μm,7.8 mm×300 mm)进行测定,流动相50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.80),检测波长280 nm,进样量100μL,流速0.6 mL/min,柱温45℃。rhGH-Fc免疫融合蛋白与聚合物分离度、理论塔板数、拖尾因子均能满足要求;rhGH-Fc免疫融合蛋白样品与对照品出峰时间一致,GH国家标准品与对照品出峰时间不同,蛋白缓冲液不出峰;rhGH-Fc免疫融合蛋白浓度在0.307~1.842 mg/mL范围内,其峰面积与上样量呈良好的线性关系(R^(2)=0.999 4);重复性验证峰面积和纯度的RSD分别为0.7%和0.1%;中间精密性验证的RSD为0.8%;准确性验证的平均回收率为99.1%,RSD为1.9%;定量限为6μg/mL。结论 采用优化后的SEC-HPLC法检测rhGH-Fc免疫融合蛋白多聚体含量,准确性有所提高,柱效与分离度符合《中国药典》四部(2020版)的相关规定,可用于对样品中高分子含量的检测。

报告基因法检测人生长激素生物学活性

目的建立报告基因法(reporter gene assay,RGA)检测人生长激素(human growth hormone,hGH)的生物学活性,并对方法进行验证。方法通过hGH能与HEK293/GH-Luc细胞膜上的hGH受体(hGH receptor,hGHR)结合激活荧光素酶(luciferase,Luc)的表达评价hGH的生物学活性。建立的方法检测条件为:样品起始浓度1μg/mL;细胞接种量为(2.45~2.66)×10^(4)个/孔;样品3倍系列稀释,共8个稀释度;孵育时间为18~24 h。通过测定Luc强度,并经四-参数拟合与国家标准品进行比较计算样品的相对生物学活性。对建立的方法进行专属性、重复性、中间精密度、相对准确度、线性范围、耐用性验证。结果产品中辅料成分及培养基中血清成分不会对活性检测结果产生影响;1批样品重复检测6次相对效价的几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)为6.794%,远低于20%;2名实验员不同时间对不同批次样品检测的相对效价GCV均低于20%;不同浓度供试品相对效价测定值的相对偏差均在±12%范围内,线性回归方程的斜率为0.982,线性范围为0.6~1.6μg/mL,决定系数(R^(2))为0.997;3批原液及1批成品在不同细胞代次、细胞密度及加样位置的条件下,相对效价测定值的GCV分别为4.758%、4.430%、7.294%和2.771%,均小于20%。结论建立的RGA法专属性、重复性、中间精密度、相对准确度、线性范围和耐用性良好,均符合应用要求,有望替代传统体内生物学活性检测方法,用于hGH的活性评价及质量控制。

人生长激素Fc融合蛋白电荷异质性全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析方法的建立及验证

目的建立全柱成像毛细管等电聚焦电泳(image capillary isoelectric focusing,iCIEF)方法分析重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)Fc融合蛋白(Fc-rhGH)的电荷异质性,并对方法进行验证。方法通过对目标蛋白浓度、助溶剂(尿素)浓度、聚焦时间的优化建立Fc-rhGH的iCIEF分析方法。采用该方法与传统平板等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)同时分析目标蛋白,并比较分析结果;对建立的方法进行特异性、准确性、精密性、定量限(limit of quantitation,LOQ)、耐用性验证。结果优化后的方法为采用8 mol/L尿素、0.35%甲基纤维素(methyl cellulose,MC)、4%两性电解质、0.5%等电点标记物混合溶液为样品缓冲液,聚焦条件为:1500 V 1 min,3000 V 5.5 min。IEF不适用于分析Fc-rhGH原液的电荷异质性。采用优化的iCIEF进行分析,目标蛋白能明显区别于非相关蛋白,且空白试剂基线平稳;准确性验证回收率在90%~110%之间,线性范围为0.25~0.75 mg/mL(目标上样量的50%~150%);重复性验证中各异构体pI的RSD均小于0.3%,峰面积百分比RSD均小于5%;定量限为0.04 mg/mL;方法的样品保存时间耐用性、两性电解质pharmalyte 3-10耐用性和MC耐用性良好。采用该方法分析Fc-rhGH理化对照品的电荷异质性,可有效分离对照品的8个电荷异质体,pI范围在5.9~6.4。结论建立的iCIEF法具有良好的特异性、准确性、精密性、耐用性,比传统平板IEF更适合高效分析Fc-rhGH的电荷异质性,对Fc-rhGH及其他Fc融合蛋白的质量控制具有重要意义。

人干扰素α2b原液中三氟乙酸残留量反相高效液相色谱检测方法的建立及验证

目的建立反相高效液相色谱(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法测定人干扰素α2b(human interferon alpha 2b,hIFNα2b)原液中三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)的残留量,并进行验证及初步应用。方法液相色谱条件为:ZORBAX 300SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相0.08%磷酸(pH 3.0)+5.0%甲醇溶液;检测时间6 min;流速0.8 mL/min;柱温35℃;紫外检测器波长210 nm;上样量20μL;等度洗脱。对方法进行系统适应性、线性、专属性、准确性、精密性、定量限与检测限及耐用性验证。同时采用建立的方法和复合型色谱柱Comixsil ACRP(100 mm×4.6 mm,5μm)测定3批hIFNα2b原液样品的TFA残留量。结果TFA在10~300μg/mL范围内线性关系良好(R^(2)=0.9984);平均加标回收率为101.8%,RSD为2.68%;重复性和中间精密度验证的RSD分别为0.46%和0.45%;定量限为10μg/mL,检测限为2μg/mL;有机溶剂、缓冲盐pH与柱温箱温度在规定条件下轻微上下浮动对检测结果无明显影响,检测波长变化时峰面积会受到影响。采用2种方法检测3批hIFNα2b原液中TFA残留量,结果均未检出。结论建立的RP-HPLC法具有较好的系统适应性、专属性、准确性、精密性及耐用性,可用于hIFNα2b原液中TFA残留量的测定。