表达长效生长激素的CHO细胞培养工艺的优化及放大

目的在NewBrunSwick31014 L生物反应器中培养表达重组人长效生长激素(recombinant human growth hormone Fc fusion protein,rhGH-Fc)的CHO细胞,优化工艺参数以提高表达量,并进行NewBrunSwick31014 L到New-BrunSwick51040 L生物反应器的工艺放大。方法在原有14 L培养工艺基础上,调节转速、通气速率等参数,并对参数调整时期进行工艺优化。通过对渗透压、乳酸、铵离子、钾离子等代谢过程产物的检测来确保代谢正常,利用HPLC法测定表达量。再根据经验公式算出可线性放大的体积依赖型参数,保持原有培养方案及补料策略不变的情况下,结合不同放大经验方法确定操作窗口,从而进行工艺放大。结果14 L生物反应器优化工艺乳酸累积量低于20 mmol/L、最终铵离子累积量为8 mmol/L、钾离子累积量为14 mmol/L、渗透压为425 osmol/kg,降温后比耗糖速率为0.12 g/(10^(9) cells·d),表达量为0.9 g/L。经检测,放大至40 L生物反应器,整个培养过程耗糖曲线及代谢产物均与14 L生物反应器中一致,表达量为1.0 g/L。结论成功优化了rhGH-Fc工程细胞大规模培养的工艺,并进行了规模放大,为rhGH-Fc的后续开发奠定了基础。

表达长效重组人生长激素-Fc融合蛋白的CHO细胞培养工艺的优化及放大

目的优化表达长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的CHO细胞培养工艺,并进行初步工艺放大。方法采用7 L生物反应器培养表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞,操作参数:转速200 r/min,温度37℃,pH 7.2±0.1,溶氧值(DO)40%。通过改变对数增长期的pH(7.2±0.1降至6.9±0.1)及平台期降温幅度(37℃降至30及33℃),检测培养过程中细胞密度、细胞活率、培养液渗透压、葡萄糖及乳酸水平、以蛋白表达量为指标,优化7 L生物反应器培养工艺。应用优化的最佳工艺进行14 L线性放大,通气量分别设置为0.5、0.1及0.03 SLPM,检测蛋白表达量。结果7 L生物反应器培养工艺最佳pH为6.9±0.1,最佳温度为33℃,该工艺下蛋白表达量高达1200 mg/L;14 L生物反应器培养工艺最佳通气量为0.03 SLPM,该工艺下蛋白表达量为880 mg/L。结论成功优化了表达rhGH-Fc融合蛋白的CHO细胞7 L生物反应器的培养工艺,并实现了14 L生物反应器的放大,本实验为后续rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了基础。

长效重组人生长激素-Fc融合蛋白纯化工艺的建立

目的建立长效重组人生长激素-Fc(recombiant human growth hormone-Fc,rhGH-Fc)融合蛋白的纯化工艺。方法rhGH-Fc融合蛋白细胞培养液经离心、低pH处理、过滤、浓缩预处理后,再经Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析进行纯化,同时检测rhGH-Fc融合蛋白的蛋白含量、纯度、等电点及宿主蛋白、宿主DNA、Protein-A残留量等指标。结果Protein-A亲和层析、CM阳离子交换层析、Q HP阴离子交换层析纯化产物的蛋白含量分别为145、132、92.4 mg,纯度分别为95.40%、95.90%和99.19%,宿主蛋白残留量分别为2500、864和71 ng/mg,宿主DNA残留量分别为329、0.56和0.12 ng/mg,Protein-A残留量分别为24.5、3.2和0 ng/mg。rhGH-Fc融合蛋白相对分子质量约97300,等电点范围为5.5~6.5,可与鼠抗人生长激素(human growth hormone,hGH)抗体发生特异性结合。结论成功建立了rhGH-Fc融合蛋白的纯化工艺,该工艺的纯化产物回收率及纯度均较高,本实验为rhGH-Fc融合蛋白的大规模生产奠定了理论基础。

重组人aFGF工程菌发酵条件的优化

目的优化重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)工程菌的发酵条件。方法采用分批补料方式,在菌体快速生长阶段,通过变速流加碳源和氮源,控制流加比例,调节pH值和溶解氧(DO)含量,实现工程菌的高密度发酵及目的蛋白的高效表达。结果当碳源与氮源流加比例为3:1时,菌体湿重可达145g/L,干重达36g/L,目的蛋白表达量达28.9%;DO控制在20%时,全菌体和裂解液中目的蛋白的表达量均最高,分别可达29.11%和44.28%。结论已初步优化了rhaFGF工程菌的发酵条件。