去泛素连接酶USP9X通过调控FOXM1介导糖酵解影响鼻咽癌细胞增殖的机制研究

目的:探讨去泛素连接酶USP9X(deubiquitin ligase 9X)是否通过调控叉头框蛋白M1(forkhead box M1,FOXM1)介导糖酵解从而影响鼻咽癌细胞的增殖能力。方法:采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测鼻咽癌组织和正常鼻黏膜组织以及鼻咽癌细胞中USP9X mRNA和蛋白的表达情况。通过病毒感染的方法将携带有特异性针对USP 9X基因的shRNA(shUSP9X)和携带有USP9X全基因的重组质粒Flag-USP9X(过表达USP9X)分别转入鼻咽癌CNE2和HNE2细胞,采用CCK-8法检测沉默或过表达USP 9X基因对鼻咽癌细胞增殖的影响,通过对细胞能量代谢和细胞外酸化率(extracellular acidification rate,ECAR)的检测分析对鼻咽癌细胞糖酵解能力的影响。通过ubibrowser_v3/数据库、免疫共沉淀和ZDOCK软件分析USP9X与FOXM1蛋白的结合情况,并通过泛素化实验观察沉默USP9X对FOXM1蛋白泛素化水平的影响;随后进一步通过实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测对FOXM1 mRNA和蛋白表达的影响。最后,采用慢病毒感染的方法在沉默USP9X表达的CNE2细胞中同时转入重组载体Flag-FOXM1恢复FOXM1的表达,再通过CCK-8法、细胞能量代谢和ECAR检测分析上调FOXM1对CNE2细胞增殖和糖酵解能力的影响。结果:与正常鼻黏膜组织相比,鼻咽癌组织中USP9X mRNA和蛋白的表达水平均显著提高(P均<0.05)。下调鼻咽癌CNE2细胞中USP9X的表达水平后,CCK-8法、细胞能量代谢检测和ECAR实验检测发现,CNE2细胞的增殖和糖酵解能力均被明显抑制(P均<0.05)。相反,上调HNE2细胞中USP9X的表达水平后,HNE2细胞的增殖和糖酵解能力均被明显提高(P均<0.05)。通过ubibrowser_v3/数据库、免疫共沉淀和ZDOCK软件证实,USP9X与FOXM1蛋白存在相互结合的关系,CNE2细胞中沉默USP9X表达水平可显著增加FOXM1的泛素化水平。在低表达USP9X的CNE2细胞中过表达FOXM1可恢复鼻咽癌细胞的增殖和糖酵解能力(P均<0.05)。结论:去泛素连接酶USP9X通过抑制FOXM1泛素化降解进而提高鼻咽癌细胞的糖酵解能力,最终促进鼻咽癌细胞的增殖。USP9X可能是鼻咽癌治疗上一个潜在的新靶点。