抑制HPV18型E7蛋白的表达对Hela细胞生物学特性及miR-204表达的影响

目的通过小干扰RNA(siRNA)抑制宫颈癌Hela细胞中人乳头瘤病毒(HPV)18型E7的表达,研究E7蛋白对Hela细胞的生物学特性和miR-204表达的影响和关系,探索HPV致癌的分子机制。方法设计合成靶向HPV18型E7基因的siRNA,转染Hela细胞,抑制HPV18-E7的表达;采用RT-PCR和Western blot分别检测Hela细胞中HPV18-E7的mRNA和蛋白水平,用流式细胞术检测Hela细胞的细胞周期和凋亡,通过荧光实时定量PCR检测miR-204的表达水平。结果 pRNAT-HPVE7与两个对照组比较,明显抑制了Hela细胞HPV18-E7的mRNA(t值分别为2.69、2.46,均P<0.05)和蛋白(t值分别为3.93、4.20,均P<0.05)的表达,细胞周期趋于正常,凋亡率增高(t值分别为-6.87、-6.92,均P<0.05),miR-204表达水平也明显升高(t值分别为0.26、0.22,均P<0.05)。结论抑制HPV18-E7基因的表达能改变Hela细胞的生物学特性和上调miR-204表达。

微RNA-204通过调控埃兹蛋白表达影响宫颈癌Hela细胞的侵袭性

目的 探讨微RNA-204（miR-204）对宫颈癌Hela细胞侵袭性的影响及其机制.方法 将Hela细胞分为4组,阴性对照组加入随机序列对照物,miR-204模拟物组和miR-204抑制物组分别加入miR-204模拟物（agomir-204）和miR-204抑制物（antagomir-204）,空白对照组不进行处理.72 h后收集细胞,荧光定量实时PCR检测各组细胞miR-204水平,免疫印迹法检测各组细胞埃兹蛋白（EZR）表达.使用在线工具预测EZR基因3′非翻译区（3′UTR）序列中的miR-204靶向序列.将EZR基因上的miR-204靶向序列克隆到双荧光素酶报告载体上,载体分别与agomir-204（miR-204模拟物组）、antagomir-204（miR-204抑制物组）、随机序列对照物（阴性对照组）共转染Hela细胞,设空白对照组不进行转染,检测各组细胞双荧光素酶相对活性比值.Transwell法检测miR-204对Hela细胞侵袭性的影响.结果 荧光定量实时PCR显示,与空白对照组和阴性对照组比较,miR-204模拟物组Hela细胞miR-204表达显著增加,而miR-204抑制物组miR-204表达显著降低（均P〈0.05）.免疫印迹显示,随着miR-204表达增加EZR蛋白表达下调.预测软件发现EZR基因3′UTR序列上1个miR-204结合靶点,测序验证显示靶点序列已经正确克隆入双荧光素酶报告载体.双荧光素酶报告基因系统检测显示,与空白对照组和阴性对照组比较,miR-204模拟物组双荧光素酶相对活性比值显著下调,而miR-204抑制物组双荧光素酶相对活性比值显著上调（均P〈0.05）.Transwell法检测显示,与空白对照组和阴性对照组比较,miR-204模拟物组穿膜细胞数显著减少,而miR-204抑制物组穿膜细胞数显著增加.结论 miR-204能够通过作用于EZR基因的靶点序列负调控宫颈癌Hela细胞EZR蛋白表达,并抑制细胞的侵袭性.