RNA干扰抑制裸鼠皮下移植瘤中Livin基因表达的实验研究

目的:利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在裸鼠皮下移植瘤中抑制Livin基因表达,探讨RNA干扰用于胃癌治疗的可行性。方法:SGC-7901细胞注射人裸鼠皮下,建立裸鼠皮下移植瘤的模型,设计靶向Livin基因的小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA),构建重组表达质粒pTZU6+1-siRNA-Livin,并导入裸鼠皮下移植瘤中,在体内诱导RNAi,采用RT-PCR和免疫化学检测Livin基因表达,Western blot检测Bax和Bcl-2改变。结果:重组质粒pTZU6+1-siRNA-Livin导入裸鼠皮下移植瘤后14d瘤体体积明显减小,Livin的mRNA和蛋白表达均明显下调。结论:RNA干扰明显抑制了靶基因Livin的表达及肿瘤细胞生长,可能与上调Bax的表达、下调Bcl-2,从而诱导肿瘤细胞凋亡有关。

YAP通过促进自噬抑制髓核细胞胞外基质分解代谢

目的探讨YAP对椎间盘髓核细胞的作用及其可能机制。方法收集重庆医科大学附属第一医院2021年3月至2022年7月接受腰椎手术患者的相对正常和退变的椎间盘组织,采用免疫组化和Western blot检测YAP在人椎间盘髓核组织中的表达差异。体外培养人原代髓核细胞,通过IL-1β处理诱导髓核细胞退变,将实验分为对照组、IL-1β组、IL-1β+LV-YAP组、IL-1β+YAP-siRNA组和IL-1β+LV-YAP+3-MA组。采用Western blot检测细胞外基质分解代谢及自噬水平变化。最后建立大鼠椎间盘退变模型,利用MRI、阿利新蓝染色及免疫组化检测YAP和LC3的表达及椎间盘退变情况。结果YAP在退变椎间盘组织的表达水平明显低于相对正常的椎间盘组织(P<0.05)。体外细胞实验结果显示,IL-1β+LV-YAP组显著提高IL-1β诱导的髓核细胞中CollagenⅡ、Aggrecan和LC3-Ⅱ的蛋白表达(P<0.05),降低MMP-3和MMP-13的蛋白表达(P<0.05),而IL-1β+YAP-siRNA组则表现出完全相反的作用。而予以自噬抑制剂3-MA预处理后明显降低IL-1β+LV-YAP组中GFP-LC3阳性颗粒数量和CollagenⅡ、Aggrecan、LC3-Ⅱ蛋白表达(P<0.05),且提高MMP-3和MMP-13的蛋白表达(P<0.05)。进一步在体内构建大鼠椎间盘退变模型,YAP过表达促进LC3表达和抑制椎间盘退变。结论YAP过表达通过促进人髓核细胞自噬抑制细胞外基质降解,从而延缓椎间盘退变。

可溶性人TRAIL诱导胃癌细胞BGC-823凋亡的研究

目的通过构建pBud-EGFP-TRAIL质粒体外观察可溶性人TRAIL蛋白(sTRAIL)对胃癌细胞BGC-823的作用。方法以EFGP基因为报告基因,sTRAIL为目的基因,构建pBud-EGFP-TRAIL双表达质粒,鉴定酶切和测序重组体。经脂质体转染法转染体外培养的胃癌细胞BGC-823,用荧光显微镜观察EGFP的表达,RT-PCR及Western blot进一步检测sTRAIL mRNA及其蛋白的表达,MTT法检测转染后对胃癌细胞的生长抑制率,TUNEL法观察细胞的凋亡情况,流式细胞仪分析转染后胃癌细胞的凋亡率。结果测序结果证实pBud-EGFP-TRAIL载体构建成功,质粒经脂质体转染后,通过表达sTRAIL蛋白对胃癌细胞发挥作用。MTT法显示转染该质粒的细胞的生长抑制率明显高于对照组,TUNEL法显示细胞核固缩,核染色质聚集或断裂,形成凋亡小体。流式细胞仪结果表明转染该质粒的细胞的的凋亡率明显高于对照组。结论在体外初步证实TRAIL能诱导胃癌细胞BGC-823凋亡。

慢性偏头痛研究进展

慢性偏头痛严重影响人类的生活质量,目前国内还未见慢性偏头痛的相关综述,本文就慢性偏头痛的流行病学特征、诱发因素、预防和治疗、动物模型建立等方面的研究进行综述。

血管性痴呆大鼠行为学及海马CA1区CREB改变的研究

目的:观察缺血性痴呆(VD)大鼠神经行为学及海马CREB的改变,并探讨两者间的关系。方法:采用双侧颈总动脉永久性结扎(2 vessels obstruction,2-VO)法建立血管性痴呆模型,8周后采用Morriss水迷宫实验测试大鼠记忆行为,海马HE染色检测神经元损伤,PCR及免疫组化检测海马CAl区CREB表达的变化。结果:模型组与正常组相比,大鼠认知功和神经元损伤程度明显,海马区CREB表达也明显降低(P<0.01)。结论:2-VO法成功制作了缺血性痴呆大鼠模型。模型大鼠脑内海马区CREB水平明显下降,其空间学习记忆障碍可能与海马区CREB表达下降有关。

下调PTEN基因对缺氧损伤后海马神经元NR2B受体调控机制研究

目的:探讨用RNAi干扰技术下调第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)对缺氧损伤引起的神经元NR2B受体表达调控机制。方法:建立海马神经元培养缺氧缺糖(Oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤模型,转染shRNAspten-GFP质粒,采用细胞比色分析(Colorimetric assay)法观察神经元膜表面NR2B含量,RT-PCR测定NR2B受体的mRNA的表达,采用Fura2-AM法测定胞内Ca2+浓度,AlamarBlue进行神经元活力分析。结果:shRNAspten-GFP能成功转染到神经元中;细胞比色法显示神经元膜表面有大量NR2B表达,与PshGFP对照组相比shRNAspten治疗组NR2B含量明显降低(P<0.05),RT-PCR测定结果与细胞比色法结果基本一致;OGD损伤组比正常组胞内Ca2+浓度显著升高(P<0.05),转染PTEN基因后胞内Ca2+浓度比PshGFP对照组明显降低(P<0.05);无关对照PshGFP组神经元活力较正常对照组和治疗组均有显著下降(P<0.05)。结论:下调PTEN基因可降低NR2B的表达,阻断Ca2+内流,增加细胞活力,从而保护神经元损伤。

氟苯尼考琥珀酸钠在大鼠体内的药代动力学研究

选取wister大鼠8只作为实验动物,分成8组,按照30 mg/kg(以氟苯尼考计)体重单次肌肉注射氟苯尼考琥珀酸钠,给药后间隔一定时间采血,以HPLC测定血样中氟苯尼考琥珀酸钠、氟苯尼考以及氟苯尼考胺,用BAPP2.0软件对动力学参数进行统计分析.结果表明,单剂量肌内注射氟苯尼考琥珀酸钠后,氟苯尼考、氟苯尼考琥珀酸钠以及氟苯尼考胺药时数据符合一级吸收一室模型,其主要的动力学参数为:Tmax 1 h,0.5 h,8 h;Cmax 6.28,4.50,3.32μg/mL;Vd、AUC、CL/F(s)分别为0.77 mg/L、37.03μg/mL和0.26 L/h;1.05 mg/L、17.22μg/mL、0.62 L/h;0.75 mg/L、85.5μg/mL、0.07 L/h;同时研究还表明氟苯尼考琥珀酸钠进入大鼠体内后,在血液中各种酶的作用下能够迅速的转化为氟苯尼考且能够较快地达到血药浓度峰值,因此提示该产品起效快,维持血药浓度时间较长,在临床上适用于敏感菌所致的急性和重性感染.

PRP基因绿色荧光蛋白载体构建及其生物学功能初步研究

目的:构建Prolifein related protein(PRP)基因荧光表达载体,并初步探讨其生物学功能。方法:提取小鼠睾丸RNA,RT-PCR扩增PRP基因编码区片段,酶切连入pEGFP-C1载体,构建含有PRP基因片段的绿色荧光表达载体PRP-pEGFP-C1。为了探讨PRP基因功能,PRP-pEGFP-C1经Lipofectamine 2000介导转染293FT细胞,MTT实验分析细胞增殖变化,流式细胞仪分析细胞周期分布。结果:质粒PRP-pEGFP-C1经测序验证,证实PRP基因已正确连入pEGFP-C1载体。免疫荧光染色显示PRP定位于293FT细胞胞浆。MTT结果表明,上调PRP基因引起293FT细胞增殖活性下降,细胞周期分布情况提示G1期细胞增加,S期细胞减少。结论:成功构建PRP-pEGFP-C1荧光表达载体,对其功能研究表明PRP具有抗人293FT细胞增殖,扰乱细胞增殖周期的功能。本研究为PRP在抗人肿瘤方面的研究提供基础。

盐酸普萘洛尔单向灌流法大鼠在体肠吸收的研究

目的研究盐酸普萘洛尔(PNH)的肠吸收情况,为制剂合理选择处方和临床药代动力学与药效学的深入研究奠定基础。方法采用大鼠单向灌流模型,引入了重量法来标示灌流液体积。考察药液浓度和pH值对肠吸收的影响。结果 PNH在全肠道均有良好的吸收,且吸收不受药物浓度和pH值的影响。结论可以考虑将PNH制成匀速释放的剂型。

氟苯尼考琥珀酸钠抗菌活性研究

研究氟苯尼考琥珀酸钠在体内转化后的抗菌效果,为临床前给药提供一定的理论依据。用微生物法,以抑菌圈直径为指标,考察氟苯尼考琥珀酸钠(前药)转化后对敏感菌的抗菌活性。给大鼠按30 mg/kg肌注前药1 h后,可以达到最大血药浓度4.0μg/mL,与氟苯尼考(母药)的抗菌活性相当。氟苯尼考琥珀酸钠在大鼠体内能够迅速转化为母药而发挥其抗菌活性。

粉防己碱对血管性痴呆大鼠齿状回S1000B蛋白表达的研究

目的:探讨粉防己碱(Tet)对血管性痴呆(VaD)大鼠齿状回S1000B蛋白表达的影响以及在血管性痴呆发病中的作用。方法:运用双侧颈总动脉永久性结扎(2-VO法)建立VaD大鼠模型,Nissl染色观察海马齿状回(DG)神经元内的尼氏小体的变化,免疫荧光观察海马DG区S100B的表达情况,F1uo-3/AM探针负载后检测各组大鼠海马内〔Ca2+〕i浓度变化,探讨Tet改善VaD大鼠神经功能的分子机制。结果:Nissl染色后,Tet干预组大鼠海马DG区尼氏小体较模型组显著增多;免疫标记发现Tet干预组大鼠DG区神经元内S100B蛋白的表达量明显增多;Tet干预组大鼠海马〔Ca2+〕i浓度显著下降(p<0.05)。结论:Tet可改善大鼠脑缺血损伤引起的学习记忆能力障碍,可能与Tet下调S100B蛋白,抑制钙离子有关。

粉防己碱对血管性痴呆大鼠齿状回S100B蛋白表达的研究

目的:探讨粉防己碱(Tet)对血管性痴呆(VaD)大鼠齿状回S100B蛋白表达的影响以及在血管性痴呆发病中的作用。方法:运用双侧颈总动脉永久性结扎(2-VO法)建立VaD大鼠模型,Nissl染色观察海马齿状回(DG)神经元内的尼氏小体的变化,免疫荧光观察海马DG区S100B的表达情况,F1uo-3/AM探针负载后检测各组大鼠海马内〔Ca2+〕i浓度变化,探讨Tet改善VaD大鼠神经功能的分子机制。结果:Nissl染色后,Tet干预组大鼠海马DG区尼氏小体较模型组显著增多;免疫标记发现Tet干预组大鼠DG区神经元内S100B蛋白的表达量明显增多;Tet干预组大鼠海马〔Ca2+〕i浓度显著下降(p<0.05)。结论:Tet可改善大鼠脑缺血损伤引起的学习记忆能力障碍,可能与Tet下调S100B蛋白,抑制钙离子有关。

骨髓间充质干细胞改善糖尿病大鼠勃起功能障碍的研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)移植到大鼠阴茎海绵体组织后对勃起功能的影响。方法:体外分离培养BMMSCs并利用形态学及流式细胞术进行鉴定证实。用腹腔注射链脲左菌素(Streptozotocin,STZ)建立糖尿病性大鼠模型,并用阿扑吗啡(Apomorphine,APO)筛选出糖尿病勃起功能障碍(Diabetes mellitus induced erectiledysfunction,DMED)大鼠模型,成模后将BMMSCs(2×106个)移植于大鼠阴茎海绵体内。2周后,分别对正常组、糖尿病组及治疗组进行海绵体内压(Intracorporeal pressure,ICP)及平均动脉压(Mean arterial blood pressure,MAP)测定并取大鼠阴茎海绵体组织,荧光显微镜下观察BMMSCs的局部存活情况,苏木素-伊红染色(Hematoxylin and eosin,HE)观察阴茎海绵体组织中血管。结果:荧光显微镜观察提示BMMSCs能在糖尿病大鼠体内存活;勃起功能测定结果表明治疗组大鼠ICP/MAP比值明显高于糖尿病组;HE染色结果显示在治疗组大鼠阴茎海绵体中血管数目[(12.75±1.89)根/HP]多于糖尿病组[(8.05±1.43)根/HP]。结论:BMMSCs能够有效改善糖尿病性大鼠勃起功能。

组织非特异性碱性磷酸酶与心肌梗死后心肌纤维化的相关性研究

目的探讨组织非特异性碱性磷酸酶(tissue non-specific alkaline phosphatase,TNAP)与心肌梗死(myocardial infraction,MI)后心肌纤维化的关系。方法收集2019年3-11月本院收治的46例急性心肌梗死患者为MI患者组,同期41例冠脉造影检查阴性患者为对照组,TNAP试剂盒测定血清TNAP活性,酶联免疫法测定血清Ⅰ型前胶原羧基端肽(procollagen typeⅠC-peptide,PⅠCP)和Ⅲ型前胶原氨基端肽(procollagenⅢN-terminal peptide,PⅢNP)的含量。收集5例陈旧性心肌梗死患者的心肌样本,天狼星红染色检测心脏纤维化水平,免疫组化方法检测TNAP表达情况。10只8周龄C57BL/6J雄性小鼠按随机数字表法分为假手术组和心肌梗死组,每组5只,心肌梗死术后2周取心脏标本,Masson染色检测其胶原面积,免疫组化方法检测TNAP表达情况。结果与对照组比较,MI患者组血清TNAP活性[(8.49±3.30)金氏单位/100 mL]显著增加(P<0.01),血清PⅠCP和PⅢNP浓度均显著增加(P<0.01);血清TNAP活性与PⅠCP和PⅢNP水平呈正相关(r=0.38,P<0.01;r=0.40,P<0.01)。与MI患者心肌梗死远端比较,梗死边界区胶原沉积和TNAP表达均显著上调(P<0.01)。与假手术组比较,心肌梗死组小鼠心脏胶原沉积显著增多(P<0.01),TNAP表达增加(P<0.01),且TNAP的表达与纤维分布区域一致。结论 TNAP与心肌梗死后心肌纤维化病理生理过程相关。

槲皮素对SGC-7901胃癌细胞生长及HSP70和EGFR表达的影响

目的观察槲皮素对胃癌细胞SGC-7901生长及HSP70和EGFR的影响。方法以台盼蓝拒染法计数胃癌细胞的生长抑制率,透射电镜从形态变化上了解凋亡的发生,流式细胞术检测细胞周期变化,免疫组化检测HSP70和EGFR的表达。结果台盼蓝拒染法计数显示槲皮素抑制SGC-7901细胞增殖的作用明显,且呈浓度和时间依赖性,槲皮素处理48 h后的IC50为14.12μmol/L。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化,流式细胞仪检测表明经10-20μmol/L的槲皮素处理,SGC-7901细胞周期阻滞于G0/G1期,经10μmol/L槲皮素处理的SGC-7901下调HSP70和EGFR蛋白的表达。结论槲皮素能抑制胃癌细胞的生长,呈时间剂量依赖性,能诱导SGC-7901发生凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制增生与诱导凋亡的机制可能与下调HSP70和EGFR的表达有关。

重庆地区妇女中高危型人乳头瘤病毒感染情况及亚型分布

目的研究重庆地区宫颈处于不同健康状态妇女的高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染情况和亚型分布。方法采集2013年6月到2014年3月到重庆市肿瘤研究所进行HPV检查的3 118例妇女宫颈细胞样本,进行HPV DNA检测,并对其中945例进行PCR扩增分型,根据宫颈健康状态进行χ2检验。结果高危型HPV总体感染率为27.49%,其中健康体检者为16.35%,宫颈炎患者为24.42%,宫颈瘤变患者为39.87%,3组之间差异有统计学意义(P<0.05);各组随年龄增加,HPV感染率升高,但各年龄组间差异无统计学意义(P>0.05)。重庆地区总体以HPV52(21.97%)型为主,其次为HPV16(20.00%)和HPV58(14.75%);各组之间,HPV亚型分布存在差异,健康体检者亚型分布从高到低依次为HPV52(26.20%)、HPV58(14.30%)和HPV51(10.70%),宫颈炎患者依次为HPV52(21.10%)、HPV58(20.00%)和HPV16(18.90%),而宫颈瘤变患者则为HPV16(29.00%)、HPV52(19.80%)和HPV58(11.50%)。HPV总的多重感染率为5.86%,随着宫颈状态恶化,多重感染率增加,但差异无统计学意义(P>0.05);健康体检者以合并HPV52的多重感染为主,而宫颈瘤变患以合并HPV16为主,宫颈炎患者合并感染的HPV亚型无明显区别。结论重庆地区宫颈处于不同健康状态的妇女HPV感染率、HPV亚型分布存在显著差异。

IL-35在慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉组织的表达与意义

目的:观察IL-35在慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉的表达与意义,完善慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉的发病机制。方法:随机选取2016年5月~2017年4月在我科住院的慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者临床资料及术中鼻息肉组织。主观症状采用视觉类比法(VAS)进行评分;纤维鼻咽喉镜检查结果采用Lanza-Kennedy评分;鼻窦CT采用Lund-Mackay评分,鼻息肉组织采用Real-time PCR方法检测IL-35 mRNA(EBI3 mRNA和IL-12A mRNA)的表达水平和ELISA方法检测息肉组织中IL-35及IL-17和IL-10蛋白的表达水平。结果:共收集51例慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者临床资料及术中鼻息肉组织,其中男性30例,女性21例,平均年龄(43.3±15.1)岁,症状评分(5.5±1.7),鼻内镜评分(6.4±2.0),CT评分(11.7±3.8)。较正常鼻黏膜组织相比,鼻息肉组织中IL-35 mRNA和蛋白均呈低表达水平,差异有统计学意义(P<0.05),而IL-17和IL-10蛋白呈高表达水平,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:IL-35可能在慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉的病理机制中起着关键的作用。

PTEN、Akt与CREB基因在偏头痛大鼠三叉神经节的表达

目的检测第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chro-mosome ten,PTEN)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase,Akt)与cAMP反应元件结合蛋白(cAMP responseelement-binding protein,CREB)基因在偏头痛模型大鼠三叉神经节的表达情况,探讨其在偏头痛发病机制中的相互关系及作用。方法通过硝酸甘油(glyceryl trinitrate,GTN)法建立大鼠偏头痛模型,分别在GTN注射后1、4、12和24h,取三叉神经节通过RT-PCR和免疫组化法对PTEN、Akt和CREB基因在mRNA和蛋白水平进行检测。结果 PTEN的基因与蛋白表达开始呈下降趋势,至GTN12h时分别为(0.42±0.07)(0.19±0.02),较对照组(1.00±0.07)(0.36±0.02)有显著降低(P<0.05),但到24h时基因与蛋白表达量分别为(3.09±0.21)(0.45±0.05),又明显回升(P<0.05);Akt与PTEN呈相反变化趋势,基因与蛋白表达在GTN4h(1.38±0.07)(0.23±0.03)和12h(1.42±0.03)(0.25±0.02)时显著增加(P<0.05),24h(0.88±0.15)(0.15±0.06)表达又降至正常水平(P>0.05);而GTN各组的CREB的基因与蛋白表达均较对照组(1.00±0.07)(0.43±0.03)有显著降低(P<0.05),24h(0.42±0.14)(0.27±0.05)表达量降到最低(P<0.05)。PTEN与Akt、CREB的基因表达呈显著负相关,r分别为-0.671,-0.484(P<0.05),蛋白表达也呈显著负相关,r分别为-0.563,-0.430(P<0.05),而Akt与CREB的基因及蛋白表达相关性不显著,r分别为0.272,-0.041(P>0.05)。结论偏头痛大鼠三叉神经节中PTEN、Akt及CREB在GTN不同时间点表达发生改变,且PTEN调控了Akt与CREB的表达,可能通过影响神经突触可塑性,参与偏头痛的发生发展过程。

蛋白激酶C参与大鼠慢性偏头痛中枢敏化

目的:本文旨在研究蛋白激酶C(PKC)是否通过中枢敏化参与慢性偏头痛病理生理过程。方法:SD雄性大鼠随机分为7组,假手术组(n=11),模型组(n=12),模型+溶剂组(n=8),PKC抑制剂4μg组(n=11),PKC抑制剂8μg组(n=10),PKC激动剂100 ng组(n=10),PKC激动剂200 ng组(n=11)。"炎性汤"反复刺激硬脑膜,模拟硬脑膜痛觉感受器的反复激活,建立慢性偏头痛大鼠模型,侧脑室给予PKC抑制剂和PKC激动剂,使用von Frey test测定大鼠面部及后足的机械痛阈值,Western blot检测PKC、CGRP、c-Fos蛋白的表达变化。结果:"炎性汤"反复刺激硬脑膜后,大鼠面部及足底的机械痛阈值显著降低,而三叉神经脊束尾核部位的CGRP、c-Fos及PKC蛋白表达显著增加。使用CHE抑制PKC可以显著增高大鼠面部及足底痛阈值,显著降低CGRP、c-Fos的表达;而使用PMA激活PKC则降低痛阈值,显著增高CGRP、c-Fos的表达。结论:本研究表明PKC可以调节机械痛阈值以及CGRP、c-Fos的表达变化,提示PKC参与慢性偏头痛中枢敏化的病理生理过程。

人EGFR显性负性突变体负调控内源性EGFR功能的机制分析

通过定向克隆法构建真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR,脂质体介导下转染体外培养的SGC-7901细胞,应用Western blotting检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达,激光共聚焦显微镜对DNEGFR-EGFP亚细胞结构定位检测;并经RT-PCR、Western blotting检测DNEGFR-EGFP对内源性EGFRmRNA水平、蛋白及磷酸化水平的影响.成功检测到DNEGFR-EGFP蛋白的表达,DNEGFR-EGFP蛋白主要定位于细胞膜,DNEGFR-EGFP能降低内源性EGFR蛋白磷酸化水平,而对内源性EGFRmRNA水平及蛋白水平无影响.研究证明DNEGFR通过降低内源性EGFR蛋白磷酸化水平负调控EGFR功能,为靶向EGFR显性负性策略在肿瘤生物治疗中的进一步研究打下基础.