下调METTL3-LYN m^(6)A-IGF2BP2通路抑制内皮细胞迁移

目的研究甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase like 3,METTL3)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)迁移能力的影响,并初步探究其作用机制。方法通过在线设计靶向METTL3第1个外显子的sgRNA,构建到lentiCRISPR v2载体;Western blot和免疫荧光染色实验检测METTL3蛋白表达水平;细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移能力;m^(6)A甲基化RNA免疫沉淀实验检测细胞迁移相关基因酪氨酸激酶LYN mRNA上m^(6)A甲基化修饰情况;荧光定量PCR(qPCR)检测LYN的表达情况;利用shRNA敲低m^(6)A识别蛋白IGF2BP1和IGF2BP2,siRNA敲低m^(6)A识别蛋白YTHDF2,qPCR检测识别蛋白敲低水平及LYN的mRNA表达情况;RNA免疫沉淀实验进一步检测IGF2BP2与LYN mRNA的结合情况;放线菌素D抑制转录后,qPCR检测LYN mRNA半衰期。结果利用CRISPR-Cas9技术成功构建METLL3基因敲低的HUVECs细胞系。METTL3基因敲低后,内皮细胞的迁移能力下降(P<0.05),细胞迁移相关基因LYN mRNA上m^(6)A甲基化修饰水平显著降低(P<0.01),且LYN mRNA的表达明显下调(P<0.05)。敲低m^(6)A识别蛋白YTHDF2和IGF2BP1,对LYN mRNA的表达量无显著影响(P>0.05),而敲低IGF2BP2,LYN的mRNA表达量显著下调(P<0.01),RNA免疫沉淀实验结果显示IGF2BP2与LYN mRNA结合。mRNA半衰期实验结果表明敲低IGF2BP2降低LYN mRNA稳定性。结论敲低METTL3抑制内皮细胞迁移,其机制可能通过IGF2BP2识别并结合LYN mRNA上m^(6)A修饰位点,调控其mRNA稳定性来发挥作用。