活化Drp1介导谷胱甘肽代谢调节失血性休克后线粒体功能的研究

目的探究失血性休克后活化Drp1介导线粒体功能改变与能量代谢之间的关系及其作用机制。方法 60只C57雌鼠(8周龄,体质量约20 g)分为休克WT组与常态WT组(n=30)。60只Drp1 KO雌鼠(C57品系,8周龄,体质量约20 g)分为休克Drp1 KO组(作缺血休克处理)与常态Drp1 KO组(n=30)。观察失血性休克后血管组织能量代谢、线粒体代谢、线粒体功能、Drp1活性变化,以及干预Drp1对休克后能量代谢、线粒体代谢及其差异代谢物的影响。对血管平滑肌细胞进行Drp1过表达、外源性谷胱甘肽(10 mmol/L)处理后观察干预Drp1及谷胱甘肽对缺氧后ROS、线粒体膜电位等线粒体功能变化。结果休克后血管组织能量代谢减低、谷胱甘肽等线粒体代谢异常、线粒体ROS产生增高2.3倍、线粒体ATP含量减少67.8%、线粒体呼吸强度OCR减弱50%(P<0.05),缺氧后ROS水平增高4倍、线粒体膜电位减少76.7%(P<0.05),并且休克和缺氧后均发现Drp1发生活化及线粒体转位(P<0.05)。常态WT组血管组织谷胱甘肽水平为(1.35±0.42)nmol/μg,休克WT组谷胱甘肽水平为(0.55±0.20)nmol/μg,休克Drp1 KO组血管组织谷胱甘肽水平(0.94±0.30)nmol/μg明显高于休克WT组(P<0.05)。Drp1过表达后血管平滑肌细胞ROS水平增加3.3倍、线粒体膜电位减少70%(P<0.05),进一步外源性补充谷胱甘肽后ROS水平和线粒体膜电位明显改善(P<0.05)。结论失血性休克后活化Drp1可通过抑制谷胱甘肽线粒体代谢引起线粒体功能障碍和机体能量代谢紊乱。

缺氧后活化Drp1通过偶联LRRK2影响多组织细胞线粒体功能的机制研究

目的探究缺氧后活化Drp1对线粒体能量代谢和有氧呼吸的调控机制。方法在心肌细胞(H9C2)、血管平滑肌细胞系(vascular smooth muscle cells,VSMC)、肠上皮细胞系(intestinal epithelial cells,IEC)中通过免疫共沉淀、免疫荧光方法观察多种细胞类型缺氧后Drp1活性变化及与线粒体损伤的关系;利用ZDOCK方法建立Drp1与同源激酶LRRK2蛋白互作模型,验证缺氧后Drp1-LRRK2偶联情况;以VSMC细胞为代表,通过Drp1点突变T595A破坏缺氧后Drp1-LRRK2的偶联,分别检测了培养基酸化程度、细胞外乳酸含量等反映无氧呼吸的指标和线粒体膜电位、ATP生成量等反映有氧呼吸的指标。结果缺氧后Drp1的Thr磷酸化水平增高、线粒体损伤明显。进一步研究发现缺氧后Drp1蛋白与LRRK2蛋白界面残基间存在大量氢键,导致缺氧后Drp1-LRRK2偶联从而影响线粒体功能。具体表现为糖酵解过程中乳酸生成的增多和线粒体有氧呼吸过程中膜电位的减低。结论缺氧后活化Drp1可通过偶联LRRK2破坏线粒体能量代谢和有氧呼吸,加重多器官组织线粒体损伤。

不同渗透压盐水对海水浸泡合并失血性休克大鼠的治疗效果观察

目的观察不同渗透压盐水对低温海水浸泡合并失血性休克大鼠的致死三联征、肝脏和肾脏功能、存活的影响。方法大鼠置于15℃海水中浸泡,同时复制失血性休克模型,制作低温海水浸泡合并失血性休克模型。浸泡2 h后,放置于温控箱中进行复温,同时用不同渗透压的液体(乳酸林格氏液LR、0.3%盐水、0.6%盐水、0.9%生理盐水)进行复苏治疗,抽血测pH、凝血功能及肝脏和肾脏功能的变化,记录体温和血压,并观察大鼠72 h的存活情况。结果海水合并失血性休克后大鼠的平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)显著降低,不同渗透压的液体复苏可显著升高平均动脉压,0.6%盐水组在输液完能维持MAP在60~70 mmHg。海水浸泡合并失血性休克后,大鼠发生致死三联征,体温和pH显著降低,凝血功能障碍;液体复苏治疗后,致死三联征有所缓解,体温和pH有不同程度升高,凝血功能得到改善,0.6%盐水组可明显改善大鼠的pH和纤维蛋白原(FIB),降低大鼠的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)和国际标准化比值(INR),与LR治疗组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。器官功能结果显示,0.6%盐水组可以显著降低血中AST、ALT、BUN和Crea水平,保护海水浸泡合并失血休克大鼠的肝脏和肾脏功能,与LR对照组比较,0.6%盐水组的AST、ALT、BUN和Crea分别降低了32.5%、29.9%、22.5%和19.6%,差异均有统计学意义(P<0.05)。同时0.6%盐水组可提高大鼠的存活率,延长存活时间,其72 h存活率为7/16,存活时间为(35.4±34.0)h,LR对照组的存活率为3/16,存活时间为(29.4±29.1)h。结论海水浸泡合并失血性休克后,适当低渗液体复苏可以减轻酸中毒和凝血功能障碍,保护器官功能,延长动物的存活时间,提高存活率。

周细胞对失血性休克大鼠血管通透性的保护作用

目的探讨周细胞(pericyte, PC)对失血性休克(hemorrhagic shock, HS)大鼠血管渗漏的保护作用。方法采用失血性休克(血压30 mmHg,维持3 h)模型,将12~24周龄SD大鼠(雌雄各半,体质量200~220 g)分成4组(n=16):假手术组(Sham组)、失血性休克组(HS组)、乳酸林格氏液治疗组(LR组)、PC治疗组(PC组),治疗组在失血性休克大鼠血压至30 mmHg,维持3 h后开始治疗,治疗12 h后取材,观察不同处理组大鼠肺静脉上的周细胞数量、肺血管及肠系膜微血管的通透性、内皮紧密连接ZO-1和黏附连接VE-cadherin的表达变化。结果与正常对照组相比,失血性休克大鼠血管渗漏明显加重(P<0.05),周细胞数量减少,内皮细胞超微结构紧密连接破坏,内皮细胞间紧密连接ZO-1和黏附连接VE-cadherin的表达明显降低(P<0.05)。LR治疗12 h后能够轻微降低失血性休克大鼠的血管通透性;紧密连接开放程度轻微降低,内皮细胞间紧密连接ZO-1和黏附连接VE-cadherin的表达轻微升高。与LR组相比,PC治疗12 h后,失血性休克大鼠肺静脉上周细胞数量增加;细胞形态恢复,超微结构紧密连接开放程度显著降低;内皮细胞间紧密连接ZO-1和黏附连接VE-cadherin的表达明显著升高(P<0.05),恢复至接近正常水平;血管渗漏明显改善,肠系膜微血管通透性显著降低。结论周细胞对失血性休克大鼠血管渗漏具有明显的保护作用。

不同组织细胞线粒体数量及功能的休克敏感性研究

目的:探究不同组织细胞线粒体数量及功能的休克敏感性差异。方法:在整体和细胞水平模拟失血性休克和脓毒性休克模型,通过mtDNA检测、线粒体形态分析和线粒体ROS检测观察休克不同时相点肠组织(肠上皮细胞)、血管组织(血管平滑肌细胞)和心肌组织(心肌细胞)中线粒体数量和功能的变化。结果:对于失血性休克(缺氧)刺激,肠组织线粒体数量的休克敏感性明显强于血管和心肌组织(P<0.05)。肠、血管、心肌组织中线粒体数量明显增多分别开始于失血性休克后0.5小时、1小时和2小时。对于脓毒性休克(LPS)刺激,肠组织线粒体数量的休克敏感性明显弱于血管和心肌组织(P<0.05)。肠、血管、心肌组织中线粒体数量明显增多分别开始于脓毒性休克后9小时、6小时和3小时。只有高浓度长时间LPS刺激才会引起肠上皮细胞线粒体数量的明显增高。各组织细胞线粒体功能对各型休克刺激的敏感性和反应程度虽然存在差异,但都晚于线粒体数量异常的发生(P<0.05)。结论:各型休克的组织器官敏感性差异可能与不同组织细胞中线粒体的休克敏感性不同有关。线粒体数量异常增加是引起休克后线粒体损伤和细胞功能障碍的始动环节,不同组织细胞线粒体的休克敏感性差异也是影响休克组织器官损伤差异的重要原因之一。

木犀草素通过抑制Drp1活性改善自噬流过程减少脑缺血再灌注后氧化应激损伤

目的探究木犀草素(luteolin)对脑缺血再灌注氧化应激损伤的保护机制。方法通过靶向药物评分方法筛选出对脑缺血再灌注损伤具有潜在治疗效果的抗氧化剂并在大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠模型中验证木犀草素的保护效果;在缺氧缺糖/复氧复糖(oxygen/glucose deprivation and re-oxygen/glucose,OGD/R)诱导的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中使用不同浓度(10和50μmol/L)木犀草素药物处理,检测MTT细胞活力及氧自由基ROS含量变化;通过免疫荧光、蛋白印迹等方法检测木犀草素处理后OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞自噬流情况及线粒体形态变化,观察木犀草素对OGD/R后ROS生成和清除过程的影响。结果木犀草素对脑缺血再灌注靶向药物评分为96.86分。TTC染色结果显示木犀草素明显减少MCAO小鼠脑梗死面积(P<0.05)。OGD/R后SH-SY5Y细胞MTT值约为正常对照组的50%,使用50μmol/L的木犀草素处理后MTT值增加至83%(P<0.05),并且木犀草素显著减弱OGD/R诱导的ROS的产生,且呈剂量依赖性(P<0.05)。激光共聚焦结果显示50μmol/L木犀草素处理OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞后自噬小体荧光强度增高64.6%(P<0.05),自噬小体与溶酶体共定位情况提高1.56倍(P<0.05)。Western blot结果显示木犀草素明显抑制OGD/R后Drp1 Ser616磷酸化水平及Drp1线粒体转位(P<0.05),改善OGD/R后SH-SY5Y细胞线粒体形态(P<0.05)。结论木犀草素对于脑缺血再灌注后氧化应激损伤具有明显保护作用,一方面它可以通过改善自噬流过程促进线粒体自噬小体的降解,加速ROS的清除效率;另一方面它还可以通过抑制Drp1活性保护线粒体形态,减少ROS的产生。