高原肺水肿大鼠肺组织基因表达谱分析

目的利用基因芯片技术分析高原肺水肿(high altitude pulmonary edema,HAPE)大鼠模型肺组织差异表达基因,为深入探讨HAPE发生的分子机制提供新线索。方法将8周龄健康雄性SD大鼠[体质量(200±20)g]按随机数字表法分为常氧对照(NC)组、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)组、低压低氧(Hypoxia)组和低压低氧复合低剂量LPS(HL)组。LPS组和HL组按照每100 g体质量尾静脉注射0.1 mL浓度为0.05%的LPS溶液,NC组和Hypoxia组给予等量生理盐水;Hypoxia组和HL组进行模拟海拔5000 m低压低氧处理6 h,NC组和LPS组于舱外同时饲养。检测肺组织的湿/干质量比(wet/dry mass ratio,WDR)、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)蛋白含量,HE染色观察肺组织病理改变。提取肺组织总RNA,采用Affymetrix基因芯片检测mRNA表达谱,采用Metascape在线基因注释和分析系统(http://metascape.org)对差异表达基因进行基因本体论(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路聚类分析。结果HL组大鼠肺组织表现出明显的充血、水肿、肺泡间隔增宽。与NC组比较,HL组大鼠肺WDR显著增加(P<0.01),BALF蛋白含量显著升高(P<0.05)。基因表达检测发现,相对NC组,Hypoxia组有79个基因表达上调,59个基因表达下调,LPS组473个基因表达上调,695个基因表达下调,HL组669个基因表达上调,1253个基因表达下调。GO和KEGG信号通路聚类分析显示:HL组差异表达上调基因主要富集于细胞因子介导的信号通路、对IL-1的反应、炎症反应调节等生物学过程,以及细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF、NF-κB、IL-17、补体和凝血级联反应等信号通路;表达下调的基因主要富集到细胞外基质组织、内皮细胞迁移调控、细胞-基质黏附等生物学过程,以及黏着斑、Wnt、cGMP-PKG、PI3K-Akt、Rap1等信号通路。HL组大鼠肺组织中NF-κB、TNF-α、IL-1β以及IL-6的mRNA表达均显著上调(P<0.01)。结论低氧复合低剂量LPS可稳定复制大鼠HAPE模型,低氧可显著增强LPS诱导的炎症、免疫反应,显著增强炎症介质的表达,促进HAPE的发生发展。

国际疾病分类体系概述及其对战伤分类信息标识体系设计的启示

国际疾病分类(ICD)体系是由WHO依据疾病特征、按照特定分类规则、对疾病信息以字母和数字代码进行表达的体系。ICD建立了国际统一的疾病分类信息标准,构成了全球医疗健康数据的基础,推动了全球医疗信息共享和应用,并根据应用需求不断完善升级,在国际上得到了广泛使用。ICD在军事领域也得到了较为普遍的应用,如美军将ICD融入其卫勤保障体系中,在提升战伤救治质量、优化卫勤决策方面发挥了基础性的积极作用。ICD最新版本(ICD-11)具有先进、科学的基础模型系统和较为完善的内容体系,在军事领域中应用具有一定的优势。因此,我军应在整合现有成果的基础上,吸收借鉴ICD发展和外军应用实践的经验,针对战伤分类信息标识的实际应用需求,构建完善的战伤分类信息标识体系,提升战伤分类的先进性和科学性,为未来军事斗争卫勤准备提供有力支撑。

丁酸对缺氧血管内皮细胞一氧化氮分泌的影响及机制研究

目的研究缺氧血管内皮细胞分泌一氧化氮(NO)下降的机制,探讨丁酸的干预作用。方法人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分为常氧组(21%O2,N)、缺氧组(1%O2,H)、缺氧+溶剂对照组(H+D)、缺氧+丁酸组(H+B)、缺氧+干扰对照组(H+Ci)和缺氧+siRNA干扰组(H+Si)。硝酸还原法检测HUVECs培养上清液NO水平;荧光定量PCR检测一氧化氮合酶(eNOS)的mRNA水平,Western blot检测eNOS蛋白水平、乙酰化水平以及组蛋白去乙酰化酶3(histone deacetylase 3,HDAC3)蛋白水平。免疫共沉淀技术检测HDAC3和eNOS的相互作用。结果缺氧6 h后,HUVECs培养上清中NO水平降低,与常氧组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);缺氧组HUVECs中eNOS蛋白水平降低,但eNOS的mRNA水平没有明显变化。与常氧组相比,缺氧组HUVECs中,HDAC3的蛋白表达没有变化,但HDAC3与eNOS的结合增加,eNOS的乙酰化水平下降。与缺氧+干扰对照组相比,缺氧+siRNA干扰组细胞中eNOS的蛋白水平显著升高。缺氧+丁酸(4 mmol/L)处理组HUVECs培养上清中NO水平升高,与缺氧+溶剂对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);同时,缺氧+丁酸(4 mmol/L)处理组HUVECs细胞中eNOS蛋白水平升高。缺氧+丁酸(4 mmol/L)处理组HUVECs中HDAC3与eNOS的结合减少,eNOS乙酰化水平降低。结论缺氧促进HDAC3和eNOS结合,抑制eNOS的乙酰化,可能通过降低eNOS蛋白的稳定性,抑制NO分泌,而丁酸可以抑制这一过程。

DNase 2α在缺氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用及机制研究

目的 探讨DNase 2α在缺氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞(rat pulmonary artery smooth muscle cells, RPASMCs)增殖中的作用及机制。方法 培养原代RPASMCs,采用3%O;缺氧处理细胞构建缺氧诱导细胞增殖模型。采用小干扰RNA(small interfering RNA sequence, siRNA)敲低Dnase2a的表达,采用质粒过表达上调细胞中Dnase2a和Hif1a的表达。采用外源性加入线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)诱导细胞增殖,使用脯氨酸羟化酶抑制剂ROXA作为HIF-1α激动剂上调细胞中HIF-1α的表达。采用MTS法检测各组细胞增殖能力,实时荧光定量PCR法检测Dnase2a的mRNA表达,Western blot法检测DNase 2α、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和细胞周期蛋白(cell cycle protein D1,Cyclin D1)的表达。结果 缺氧可诱导RPASMCs增殖,并上调DNase 2α的表达(P<0.05)。siRNA可显著降低RPASMCs中Dnase2a的表达(P<0.05),并显著增强缺氧诱导的RPASMCs增殖(P<0.05),同时显著上调PCNA和Cyclin D1的蛋白表达(P<0.05)。过表达Dnase2a可显著上调RPASMCs中DNase 2α的表达(P<0.05),并显著抑制缺氧诱导RPASMCs增殖(P<0.05)。外源性加入mtDNA可诱导RPASMCs增殖,而过表达Dnase2a可显著抑制mtDNA诱导的RPASMCs增殖(P<0.05)。过表达Hif1a或使用脯氨酸羟化酶抑制剂ROXA可显著上调HIF-1α表达,并显著上调DNase 2α的蛋白表达(P<0.05)。结论 DNase 2α可抑制缺氧或线粒体DNA诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖,缺氧诱导的DNase 2α表达上调与HIF-1α有关。

DUSP1在缺氧RAW264.7细胞中的表达及其对炎症免疫反应的调控作用

目的探讨双特异性磷酸酶1(dual specificity phosphatase-1,DUSP1)在缺氧小鼠RAW264.7巨噬细胞中的表达情况及其在缺氧诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症免疫反应中的调控作用。方法将RAW264.7细胞分别在缺氧(1%O2)条件下培养不同时间(12、24和36 h),常氧组在常氧(21%O2)条件下培养;采用RNA干扰技术干扰RAW264.7细胞中Dusp1表达并进行缺氧暴露24 h。收集各对应时间点细胞培养上清液和细胞标本,提取细胞总RNA和总蛋白。使用qRT-PCR检测Dusp1、Il1b、Il10和Tnfa的mRNA表达,采用Western blot检测DUSP1的蛋白表达,采用ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β、IL-10和TNF-α的分泌水平。结果与常氧组(缺氧0 h)相比,缺氧暴露后RAW264.7细胞中DUSP1的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),蛋白表达在缺氧暴露24 h时达到峰值;缺氧暴露24 h和36 h Il1b、Il10 mRNA表达均显著升高(P<0.05);缺氧暴露12 h时Tnfa mRNA表达明显降低(P<0.05);缺氧暴露12、24 h和36 h RAW264.7细胞IL-1β的分泌水平明显增加(P<0.05)。与干扰序列对照组相比,干扰Dusp1表达后,缺氧暴露24 h RAW264.7细胞中IL-1β的mRNA表达和分泌水平明显增加(P<0.05),IL-10的分泌水平明显增加(P<0.05),而TNF-α的mRNA表达和分泌水平明显降低(P<0.05)。结论缺氧能够诱导RAW264.7巨噬细胞中DUSP1表达上调,DUSP1通过调节IL-1β、IL-10和TNF-α的表达和/或分泌参与调控缺氧诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症免疫反应。

TLR9-JNK信号通路调控缺氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖

目的研究Toll样受体-9(toll-like receptor 9,TLR9)在缺氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞(rat pulmonary artery smooth muscle cells,RPASMCs)增殖中的作用及机制。方法采用MTT、Western blot、PCR法检测RPASMCs的相对增殖水平、蛋白表达水平、mRNA转录水平。①3%O_(2),36 h处理RPASMCs,构建缺氧诱导RPASMCs增殖的细胞模型,检测细胞相对增殖水平、TLR9、磷酸化c-jun氨基末端激酶(phosphorylated c-jun N-terminal kinase,p-JNK)蛋白表达水平。②缺氧条件下分别使用小干扰RNA序列(small interfering RNA sequence,siRNA)或20μmol/L TLR9激动剂ODN 1826敲低或活化TLR9,检测RPASMCs的细胞增殖水平和c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化水平。③缺氧时使用5μmol/L JNK抑制剂SP600125处理RPASMCs,检测缺氧条件下细胞相对增殖水平。④缺氧时复合使用20μmol/L TLR9激动剂ODN 1826和5μmol/L JNK抑制剂SP600125处理RPASMCs,检测RPASMCs的JNK磷酸化水平和相对增殖水平。结果缺氧组RPASMCs的相对增殖水平[(1.30±0.07),P<0.01]以及TLR9蛋白水平[(1.70±0.22),P<0.05]和JNK磷酸化[(1.83±0.18),P<0.01]都显著高于常氧组。敲低TLR9显著抑制缺氧诱导的RPASMC增殖[(0.64±0.09),P<0.01]并减少JNK磷酸化[(0.49±0.01),P<0.001]。TLR9激动剂显著促进RPASMCs增殖[(2.01±0.08),P<0.001]且增加JNK的磷酸化[(2.11±0.33),P<0.01]。JNK抑制剂抑制RPASMCs增殖[(0.70±0.06),P<0.05]。与缺氧+TLR9激动剂组相比,缺氧+TLR9激动剂+JNK抑制剂组RPASMCs JNK磷酸化[(0.82±0.14)vs(1.59±0.30),P<0.001]和相对增殖水平[(1.08±0.05)vs(1.35±0.02),P<0.001]都显著降低。结论缺氧时TLR9通过激活JNK通路促进大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖。

7种不同组织来源细胞缺氧损伤效应评价

目的观察缺氧条件下7种不同类型细胞损伤程度,筛选对缺氧损伤敏感的细胞模型。方法选择CCD 841 CoN、GES-1、HUVEC、HEB、HEK-293、HBE和L02等7种不同组织来源的细胞,利用低氧工作站构建不同缺氧浓度(5%O_2和1%O_2)细胞缺氧模型,使用CCK-8和LDH方法检测细胞增殖及损伤情况。并用红景天(0.625μmol/L、2.5 mmol/L)和丁苯酞(1、2μmol/L)于缺氧开始时处理细胞,观察是否可改善缺氧细胞损伤。结果与21%O_2相比,1%O_2处理24 h时,HEB细胞增殖能力显著降低(P<0.05);与21%O_2相比,5%O_2与1%O_2处理24 h HEB、HUVEC、HBE、HEK-293、CCD 841 CoN、GES-1和L02细胞其上清中LDH酶活力均显著升高(P<0.05,P<0.01);在HEB细胞中,红景天(2.5 mmol/L)和丁苯酞(1μmol/L)处理可显著逆转低氧诱导的细胞增殖和细胞活力降低(P<0.05);红景天(2.5 mmol/L)和丁苯酞(1μmol/L)处理可显著逆转低氧诱导的LDH酶活力升高(P<0.05,P<0.01)。结论 HEB细胞对缺氧最为敏感,是较好的抗缺氧损伤药物效应研究细胞的模型。

缺氧诱导线粒体DNA释放后激活cGAS-STING通路促进肺动脉平滑肌细胞增殖

目的探究线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)释放在缺氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞(rat pulmonary arterial smooth muscle cells,RPASMCs)增殖中的作用及可能机制。方法①1%O_(2)缺氧处理RPASMCs分3组(n=3):常氧组、缺氧24 h组、缺氧48 h组。②环孢素A(CsA)抑制线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)分为3组(n=3):常氧组、缺氧48 h组、缺氧48 h+CsA处理组。③siRNA敲低干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)表达分为3组(n=3):常氧+NC组、缺氧48 h+NC组、缺氧48 h+si-STING组。④采用CCK-8检测细胞增殖,RT-qPCR、Western blot检测环状GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)、STING、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的基因与蛋白表达,qPCR检测细胞质mtDNA释放,ELISA检测细胞培养上清中CXC趋化因子配体10(C-X-C motif chemokine ligand 10,CXCL10)水平。结果缺氧可诱导RPASMCs释放mtDNA(P<0.01),显著上调cGAS、STING、PCNA的表达(P<0.05),并增强CXCL10的分泌(P<0.01),进而促进RPASMCs增殖(0.44±0.02 vs 0.72±0.03)(P<0.05)。抑制MPTP可阻断mtDNA释放(P<0.01),显著下调cGAS、STING、PCNA的表达(P<0.01),降低CXCL10的分泌水平(P<0.01),并显著抑制缺氧诱导的RPASMCs增殖(0.74±0.12 vs 0.43±0.06)(P<0.01)。敲低STING可显著下调PCNA的表达(P<0.05),降低CXCL10的分泌水平(P<0.01),并显著抑制缺氧诱导的RPASMCs增殖(0.68±0.03 vs 0.58±0.01)(P<0.01)。结论缺氧可诱导平滑肌细胞释放mtDNA,介导缺氧诱导的平滑肌细胞增殖,其机制可能与cGAS-STING通路的激活有关。

SOX6-SOCS3通过STAT3信号通路调控缺氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖

目的探究SRY盒转录因子6(SRY-Box transcription factor 6,SOX6)-细胞因子信号转导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)在缺氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary artery smooth cells, HPASMCs)增殖中的作用及其可能机制。方法 (1)4%O2缺氧处理HPASMCs分为3组:常氧组、缺氧24 h组、缺氧48 h组(n=3)。(2)使用小RNA干扰SOX6或SOCS3表达,干扰SOX6表达分为4组:si-SOX6-NC组、si-SOX6-1组、si-SOX6-2组、si-SOX6-3组(n=3),干扰SOCS3表达分为3组:si-SOCS3-NC组、si-SOCS3-1组、si-SOCS3-2组(n=3)。(3)构建慢病毒过表达SOX6细胞后缺氧处理48 h,分为4组:常氧对照组、过表达SOX6组、缺氧对照组、缺氧+过表达SOX6组(n=3)。(4)采用CCK-8检测各组细胞增殖,RT-qPCR、Western blot检测各组SOX6、SOCS3、磷酸化信号转导与转录激活因子3(phosphorylated-signal transduction and activators of transcription 3,p-STAT3)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达。结果缺氧可降低SOX6和SOCS3的表达(P<0.01),不仅能诱导HPASMCs增殖(P<0.05),还能显著上调p-STAT3、PCNA的表达(P<0.05)。在常氧条件下,干扰SOX6或SOCS3可显著增强HPASMCs的增殖(P<0.05),细胞中p-STAT3、PCNA的表达也显著升高(P<0.01)。在缺氧条件下过表达SOX6可显著抑制缺氧诱导的HPASMCs增殖(P<0.01),并显著降低p-STAT3、PCNA的表达(P<0.01)。结论 SOX6-SOCS3可抑制缺氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞的增殖,其机制可能与抑制STAT3信号通路有关。