髓系细胞缺失ATG5对疟原虫特异性CD4+T细胞免疫记忆形成的影响

目的研究髓系细胞缺失ATG5对疟原虫特异性CD4^(+)T细胞免疫记忆形成的影响。方法构建髓系细胞特异缺失ATG5的条件敲除小鼠,在其感染约氏疟原虫Plasmodium yoelii(P.yoelii)17XNL自愈后1个月、3个月和6个月分别再次感染该虫株,观察其原虫率变化。同时采用流式细胞术检测髓系细胞ATG5条件缺失感染自愈小鼠疟原虫特异性免疫记忆CD4^(+)T细胞频率和数量的变化。结果成功构建髓系细胞ATG5条件缺失实验小鼠(ATG5^(f/f)-LysM cre^(+))。与对照组(ATG5^(f/f)-LysM cre^(-))相比,初次感染P.y 17XNL的实验组小鼠(ATG5^(f/f)-LysM cre^(+))原虫血症明显低于对照组小鼠(ATG5^(f/f)-LysM cre^(-))。在上述感染小鼠自愈后1个月、3个月和6个月再次感染P.y 17XNL,结果发现感染小鼠原虫血症与初次感染相比,均显著降低,且所有感染小鼠在攻击后6~8 d内完全清除体内疟原虫。流式检测后发现,ATG5^(f/f)-LysM cre^(+)与ATGf/f-LysM cre^(-)小鼠感染自愈后3个月或6个月,其脾脏疟原虫特异性免疫记忆CD4^(+)T细胞频率和数量均无统计学差异。结论P.y 17XNL感染自愈小鼠可以有效诱导宿主免疫记忆,但髓系细胞缺失ATG5不影响疟原虫特异性CD4^(+)T细胞免疫记忆形成。

弓形虫病发病的免疫学机制研究进展

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫,对人类和动物的健康造成了严重危害。宿主感染弓形虫后,可引起弓形虫脑病、眼病,甚至先天性弓形虫病。近年来,对弓形虫病发病的免疫学机制进行了大量研究,本文拟探讨宿主重要器官弓形虫病发病的特异性免疫应答机制,为弓形虫病免疫诊断、治疗及预防提供依据。

巨噬细胞吞噬pRBCs后炎症因子分泌的机制研究

目的体外研究小鼠骨髓诱导巨噬细胞BMDMs吞噬pRBCs后能否形成LC3相关吞噬(LC3-associated phagocytosis,LAP)及其在调节BMDMs分泌炎症因子中的作用。方法构建BMDMs与pRBCs体外共孵育及吞噬研究平台。体外诱导小鼠BMDMs,用CFSE标记P.y 17XNL感染的小鼠红细胞(parasitized red blood cells,pRBCs),共孵育后采用流式细胞术观察BMDMs对pRBCs的吞噬效率并选定最佳条件,用CBA法检测培养上清中炎症因子浓度。随后分离诱导巨噬细胞ATG5条件缺失小鼠(Lyz2-Cre-ATG5flox/flox)来源的BMDMs,观察其吞噬pRBCs后胞内ATG5缺失对其分泌炎症因子的影响,通过免疫荧光染色及共聚焦观察ATG5缺失对BMDMs吞噬pRBCs后,胞内LC3-Ⅱ与pRBCs共定位的影响。结果体外成功诱导BMDMs,流式细胞术检测证实巨噬细胞纯度>95%。在BMDMs与p RBCs按照1∶20孵育下,随孵育时间延长,吞噬比例显著增加,其中孵育4 h时,吞噬比例最高(>50%)。CBA炎症因子检测后发现,BMDMs吞噬pRBCs后,其IL-6、MCP-1及TNF-α的分泌增强。进一步发现,与对照组相比,ATG5-/-BMDMs吞噬pRBCs后能显著增强IL-6和TNF-α的分泌。免疫荧光及共聚焦观察发现,ATG5缺失能明显抑制BMDMs吞噬pRBCs后胞内LC3-Ⅱ与pRBCs共定位情况。结论巨噬细胞吞噬pRBCs后,可能通过LAP依赖方式抑制其胞内炎症因子的分泌。

人体寄生虫学年轻教员培养的探索

青年教师肩负着院校希望,对其培养成功与否直接决定着大学教育事业的成败兴衰。因此,如何让青年教员更快打牢教学基础、丰富教学经验具有重要的现实意义。基于此,文章以人体寄生虫学教学为例,系统提出提升年轻教师教学能力的方法和途径,希望对他们的成长有所帮助。

肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育影响的研究

目的探讨肝细胞局部补体对疟原虫红外期发育的影响。方法分别提取Hepa1-6和HepG2-CD81细胞RNA,逆转PCR扩增C3、C3aR1、C5、C5aR1基因。Hepa1-6细胞和HepG2-CD81细胞悬液分别加入蛋白酶和磷酸酶裂解,2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)法测定蛋白浓度,用蛋白质免疫印迹(Western blotting)测定肝细胞内补体和受体表达情况。将表达红色荧光蛋白(RFP)的约氏疟原虫BY265-RFP株、伯氏疟原虫ANKA株的昆明小鼠供斯氏按蚊吸血,17~19 d后解剖分离斯氏按蚊唾液腺,收集子孢子,在24孔板中按50000个子孢子/孔加入HepG2-CD81细胞(105个/孔)孵育6、12、24 h;另设置共孵育3 h后加入C5aR拮抗剂(40 nnmol/L,每孔500μl)的组别。经4%多聚甲醛固定、封闭,非透膜组加入一抗C3a兔抗人IgG抗体(1∶500)或rC5a兔抗人IgG抗体(1∶500)4℃孵育过夜,加入绿色Dylight 488荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入DAPI染色液孵育5 min;透膜组加入一抗UIS4山羊多克隆抗体(1∶500)4℃孵育过夜,加入绿色IFKineTM荧光标记的驴抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入CD88兔多克隆抗体(1∶400)4℃孵育过夜,加入红色Dylight 649荧光标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶400)孵育1 h,加入DAPI染色液孵育5 min,激光共聚焦显微镜观察补体在纳虫空泡周围的富集情况。取眼镜蛇毒因子(CVF)腹腔注射至C57BL/6小鼠,为CVF组;并设置C3-/-组(C3全基因敲除C3-/-小鼠)和对照组(C57BL/6小鼠)。取10000个约氏疟原虫子孢子感染各组小鼠,取肝脏提取总RNA后逆转录合成cDNA,荧光定量PCR测定疟原虫18S rRNA含量,肝脏虫荷用18S rRNA的相对含量表示。以尾静脉注射方式,用200个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)10只、C3aR^(-/-)小鼠10只;1000个约氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)5只、C5aR全基因敲除C5aR^(-/-)小鼠6只和肝脏C5aR条件性敲除Alb-cre+/+C5aRflox/flox杂交小鼠5只;1000个伯氏疟原虫子孢子感染对照组(C57BL/6小鼠)6只和C5aR^(-/-)小鼠6只,感染后3 d开始取尾静脉血,制成薄血膜涂片,吉氏染色后观察,至所有小鼠均出现红内期疟原虫为止。采用Graphpad prism 9.0软件进行统计学分析。正态分布的数据采用t检验比较连续变量,两两差异比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行多重比较;非正态分布数据比较采用Mann-Whitney U检验。结果PCR结果可见,Hepa1-6细胞株内扩增出C3(358 bp)、C5(267 bp)及其受体C3aR(222 bp)、C5aR(388 bp)基因;HepG2-CD81细胞株内扩增出C3(202 bp)、C5(220 bp)、C3aR(299 bp)和C5aR(374 bp)基因。Western blotting检测结果发现,两种细胞均有C3、C5、C3aR和C5aR蛋白表达。激光共聚焦显微镜成像可见,细胞核经DAPI染色呈蓝色荧光,约氏疟原虫红外期呈红色自发荧光,非透膜组HepG2-CD81细胞内高表达的C3a和C5a呈绿色荧光,与纳虫空泡分布区域重叠;透膜组C5aR(粉色)与纳虫空泡膜(绿色)重叠;加入C5aR拮抗剂组别的纳虫空泡膜上仍有C5aR表达。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、CVF组、C3-/-组的肝脏虫荷(18S rRNA相对含量)分别为0.954±0.523、0.958±0.231、0.638±0.437,3组间差异均无统计学意义(P>0.05)。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C3aR^(-/-)小鼠分别在(5.30±0.78)d和(5.30±0.78)d后出现红内期;伯氏疟原虫子孢子感染后,对照组和C5aR^(-/-)小鼠分别在(3.67±0.47)d和(3.83±0.69)d后出现红内期;2组基因敲除小鼠红内期出现时间与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。约氏疟原虫子孢子感染后,对照组、Alb-cre^(+/+)C5aR^(flox/flox)小鼠和C5aR^(-/-)小鼠红内期的出现时间分别为(4.00±0.00)、(4.00±0.00)、(4.17±0.37)d,差异无统计学意义(P>0.05)。结论肝细胞局部补体活化对疟原虫红外期发育无显著影响。

鼠疟原虫感染大鼠和小鼠的种特异性分析

目的用约氏疟原虫(P.y)BY265株和伯氏疟原虫(P.b)ANKA⁃luciferase株感染小鼠和大鼠,分析鼠疟原虫感染宿主的种特异性。方法制备P.y和P.b的子孢子和裂殖子。分别用5×104的P.y和P.b子孢子经尾静脉注射感染SD大鼠、BALB/c小鼠(P.y感染组,5只/组)和SD大鼠、C57BL/6J小鼠(P.b感染组,5只/组),每日取尾静脉血涂片镜检,记录红内期疟原虫出现的时间。P.y子孢子感染SD大鼠和BALB/c小鼠后42 h取肝组织,实时荧光定量PCR(qRT⁃PCR)检测肝组织疟原虫18S rRNA的相对表达量。P.b子孢子感染SD大鼠和C57BL/6J小鼠后42 h活体成像法检测肝脏荧光值。分别用1×10^(8)、1×10^(7)、1×10^(6)的P.y和P.b被感染红细胞(iRBC)感染SD大鼠(P.y感染组、P.b感染组)和易感小鼠(BALB/c、C57BL/6J)(阳性对照组),每日取尾静脉血涂片镜检,计算原虫血症。分别用P.y、P.b裂殖子感染SD大鼠和易感小鼠,每日取尾静脉血涂片镜检,计算原虫血症;当大鼠、小鼠原虫血症达到峰值后,每隔8小时取尾静脉血涂片镜检,持续24 h,分析疟原虫发育节律;观察大鼠、小鼠实验性脑型疟(ECM)的发生情况。分别用P.y、P.b裂殖子感染T、B细胞缺陷的Rag2⁃KO SD大鼠、野生型SD大鼠和易感小鼠,每日取尾静脉血涂片观察,计算原虫血症。两组数据之间比较采用非配对t检验,组间原虫血症趋势比较采用双因素方差分析(two⁃way ANOVA)。结果P.y感染组的SD大鼠、BALB/c小鼠,P.b感染组的SD大鼠、C57BL/6J小鼠体内疟原虫均能完成肝期发育,于第3天进入红内期。qRT⁃PCR结果显示,P.y子孢子感染SD大鼠、BALB/c小鼠体内疟原虫特异性18S rRNA相对表达量分别为(1.63±0.381)、(1.00±0.232),二者差异有统计学意义(t=2.801,P<0.05)。活体成像结果显示,P.b子孢子感染SD大鼠体内荧光度值为(6.243±1.425)×10^(7),高于C57BL/6J小鼠的(1.624±0.530)×10^(7)(t=6.077,P<0.01)。红内期iRBC感染结果显示,3种剂量的P.y感染组SD大鼠的原虫血症趋势[峰值分别为(3.500±1.042)%、(2.850±0.627)%、(3.400±0.962)%]之间差异无统计学意义(F=0.145,P>0.05),但与阳性对照组[峰值为(43.928±9.448%)]差异有统计学意义(F=84.040、63.760、58.400,均P<0.01);P.b感染组SD大鼠的原虫血症趋势[峰值分别为(11.468±1.362)%、(7.398±2.387)%、(2.984±1.881)%]随感染剂量降低而下降,其中1×10^(8)、1×10^(6)剂量组原虫血症趋势与阳性对照组[峰值为(10.682±4.278)%]差异有统计学意义(F=13.83、17.320,均P<0.01),1×10^(7)剂量组原虫血症趋势与阳性对照组差异无统计学意义(F=2.234,P>0.05)。裂殖子感染结果显示,感染后6d,P.y感染组SD大鼠、BALB/c小鼠原虫血症分别为(0.902±0.235)%、(17.420±4.105)%,二者差异有统计学意义(t=9.943,P<0.01);P.b感染组SD大鼠、C57BL/6J小鼠原虫血症分别为(6.804±2.978)%、(9.290±1.055)%,二者差异无统计学意义(t=1.759,P>0.05);P.b感染组SD大鼠、C57BL/6J小鼠ECM累计发生率分别为11/15、13/15,二者差异无统计学意义(t=1.414,P>0.05)。发育节律分析结果显示,P.y感染组SD大鼠发育节律与BALB/c小鼠不同,未呈现24 h规律;P.b感染组SD大鼠发育节律与C57BL/6J小鼠相近,具有24 h规律。感染后18 d,P.y感染组Rag2⁃KO SD大鼠、野生型SD大鼠、BALB/c小鼠原虫血症分别为(1.326±0.908)%、0、(33.937±3.453)%,Rag2⁃KO SD大鼠与野生型SD大鼠之间原虫血症差异有统计学意义(t=2.267,P<0.05);感染后17 d,P.b感染组Rag2⁃KO SD大鼠、野生型SD大鼠的原虫血症为(19.685±5.752)%、(0.007±0.013)%(t=2.499,P<0.05),阳性对照组仅存的1只C57BL/6J小鼠的原虫血症为25.410%。结论P.y和P.b子孢子均能感染大鼠并完成肝期发育进入红内期。鼠疟原虫不易感染大鼠的影响因素在红内期,大鼠体内鼠疟原虫可被清除;P.y对宿主种属表现出更强的选择性;P.b感染大鼠的急性期原虫血症和ECM发生率与小鼠差异均无统计学意义。适应性免疫在大鼠彻底清除体内鼠疟原虫中发挥重要作用。

人体寄生虫学课程思政建设现状及对策分析

为了落实立德树人的根本任务,全面推进课程思政建设须将价值塑造、知识传授和能力培养三者融为一体,以实现“三全育人”。《人体寄生虫学》是医学教育必须的专业基础课程,是开展思政教育的良好载体。但当前人体寄生虫学课程思政存在教师思政素养不够、体制机制健全程度不高和课程思政时间有限等问题。本文从《人体寄生虫学》这门课程入手,分析了应用本课程进行课程思政的独特优势、意义及当前现状,探究了如何挖掘课程思政内容,通过将课程思政引入专业课程,帮助学生树立正确的三观。

全球首款疟疾疫苗RTS,S/AS01的研发和应用

2021年10月,WHO宣布疟疾中、高度流行区儿童可接种RTS,S/AS01疟疾疫苗的消息,引起了全球广泛关注。本文就RTS,S/AS01疟疾疫苗的研发历程及其在疟疾防控中的作用进行阐述。

疟疾疫苗研制及其存在的问题

历史上,传染病的最终控制和消除均得益于有效疫苗的接种。60多年来,研究者们一直致力于有效疟疾疫苗的研制。近年来,亚单位疟疾疫苗RTS,S和减毒子孢子疫苗的临床试验效果使研究者们看到了研制安全、有效疟疾疫苗的希望。然而,有效疟疾疫苗的最终研制成功还存在诸多的技术问题和理论瓶颈。本文从疟原虫的生物学及其感染免疫学特点角度对目前疟疾疫苗研制过程中所面临的问题进行分析,以期为有效疟疾疫苗的最终研制成功提供参考和努力的方向。

高剂量氯磷酸脂质体处理对小鼠体内约氏疟原虫生长的影响及机制初探

目的探究高剂量氯磷酸脂质体(CL)处理对小鼠体内约氏疟原虫17XL(Py17XL)生长的影响。方法取61只雌性BALB/c小鼠,随机分成5组:高剂量CL处理组(简称CL处理组,23只)和对照脂质体处理组(29只)小鼠分别于感染Py17XL前1 d和感染后2、5 d,尾静脉注射高剂量CL(5μg/μl 200μl)和等量对照脂质体;健康CL处理组(3只)和健康对照脂质体处理组(3只)小鼠在相同时间尾静脉注射高剂量CL(5μg/μl 200μl)和等量对照脂质体;空白对照组(3只)小鼠不作任何处理。于感染后每天采集CL处理组和对照脂质体处理组小鼠(各5只)尾静脉血,涂片后显微镜下观察原虫血症,并统计小鼠存活情况。感染后0、3、6 d,取CL处理组和对照脂质体处理组小鼠(每次3只)脾脏,分离脾淋巴细胞,采用流式细胞术检测两组小鼠疟原虫特异性CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞的增殖能力和γ干扰素(IFN-γ)分泌水平,ELISA检测感染后6 d的小鼠血清抗疟原虫Ig G抗体水平。感染后2、4、6 d,取CL处理组、对照脂质体处理组、空白对照组小鼠(每次3只)脾脏,分离脾淋巴细胞,采用流式细胞术检测CL耗竭的细胞种类,吉氏染色后显微镜下观察对照脂质体处理组小鼠(每次2只)脾脏树突状细胞的疟原虫感染情况。结果CL处理组和对照脂质体处理组小鼠均在感染后7 d出现死亡(CL处理组2只,对照脂质体处理组3只),且感染后8 d全部死亡,差异无统计学意义(χ^(2)=0.360,P>0.05)。感染Py17XL后,CL处理组小鼠的原虫血症均低于对照脂质体处理组小鼠,其中感染后6 d,CL处理组小鼠原虫血症为(34.537±8.165)%,与对照脂质体处理组小鼠的(61.303±8.799)%差异有统计学意义(F=1.821,P<0.05)。感染后2、4、6 d,CL处理组小鼠脾脏中的单核细胞(CD11b^(+))占比分别为(6.240±0.605)%、(8.277±0.411)%、(6.573±0.246)%,树突状细胞(CD11c^(+))占比分别为(3.700±0.599)%、(8.003±0.655)%、(3.920±0.534)%,巨噬细胞(F4/80;)占比分别为(4.830±0.695)%、(11.007±1.121)%、(2.743±0.395)%,均低于对应的对照脂质体处理组,且差异有统计学意义(F=5.945、2.075、7.091,P<0.05)。感染后3、6 d,CL处理组与对照脂质体处理组小鼠疟原虫特异性CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞的增殖能力和IFN-γ分泌水平差异均无统计学意义(P>0.05)。感染后6 d,CL处理组小鼠稀释10倍的血清抗疟原虫IgG抗体水平为2.241±0.056,低于对照脂质体处理组的2.490±0.090,差异有统计学意义(F=27.66,P<0.05)。镜检结果显示,感染后2、4 d,对照脂质体处理组小鼠的CD11c^(+)细胞内并未发现疟原虫,绝大多数感染后6 d的CD11c^(+)细胞内发现了大量的疟原虫。结论高剂量CL耗竭巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞后,并非通过调节小鼠抗红内期疟原虫的固有免疫和适应性免疫应答参与抑制Py17XL的增殖和发育。

硝喹对斯氏按蚊体内不同时期约氏疟原虫发育的影响

目的观察硝喹对斯氏按蚊体内不同时期约氏疟原虫发育的影响。方法在感染约氏疟原虫1 d前给予常规蔗糖水或硝喹蔗糖水(含100μmol/L硝喹)供斯氏按蚊吸食,停糖水24 h后用感染约氏疟原虫的昆明鼠血餐,观察硝喹处理后约氏疟原虫在蚊胃内的卵囊数量变化。感染6、14 d后停常规蔗糖水24 h,随后给予常规蔗糖水或硝喹蔗糖水供斯氏按蚊吸食,观察斯氏按蚊血淋巴及唾液腺中的约氏疟原虫子孢子数量变化。结果感染前1 d将斯氏按蚊暴露于硝喹蔗糖水后,感染第7天蚊胃中约氏疟原虫卵囊数量([119.2±16.1)只]较常规蔗糖水组([207.3±21.8)只]显著降低(t=3.207,P <0.05)。感染第6天停常规蔗糖水24 h,将斯氏按蚊暴露于硝喹蔗糖水后,按蚊血淋巴中约氏疟原虫子孢子数量峰值([952.3±22.7)只]在感染第14天出现,常规蔗糖水组按蚊血淋巴中子孢子数量峰值([1 287.0±39.0)只]在感染第12天出现;感染第17天,硝喹蔗糖水和常规蔗糖水组按蚊唾液腺中子孢子数量分别为(9 467.0±1 304.0)只和(10 533.0±758.7)只,差异无统计学意义(t=0.707,P=0.506)。感染第14天停常规蔗糖水24 h,将斯氏按蚊暴露于硝喹蔗糖水后,按蚊唾液腺中约氏疟原虫子孢子数量([21 900.0±2 613.0)只]较常规蔗糖水处理组([10 533.0±732.3)只]显著增加(t=4.188,P <0.05)。结论在斯氏按蚊感染疟原虫不同时期给予硝喹处理对其体内约氏疟原虫发育影响不一,未感染斯氏按蚊经硝喹处理后可减少疟原虫传播。

蛋白激酶9在约氏疟原虫生长发育中的作用

目的探究蛋白激酶9 (PK9)在约氏疟原虫生长发育中的作用。方法基于疟原虫PlasmoDB数据库,查找约氏疟原虫致死株17XL (Py17XL)的PK9序列信息, BLAST比对Py PK9和恶性疟原虫PK9(Pf PK9)以及人蛋白激酶p78的同源性。提取Py17XL株野生型(WT)基因组DNA,设计引物, PCR扩增PK9基因。采用CRISPR-Cas9技术,将同源臂与sgRNA序列一起连接到PYC-MCS质粒中,构建PK9基因敲除(PK9KO)重组质粒。重组质粒电转至Py17XL虫株内,经乙胺嘧啶筛选、克隆,进行PCR鉴定和测序。10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT感染组和PK9KO感染组,每组5只,重复3次实验。每鼠腹腔注射1×105个红内期疟原虫,每隔24 h取血检测小鼠原虫血症,观察小鼠存活情况。200只3~5日龄的斯氏按蚊随机分为WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组,每组100只。于吸血8 d后解剖蚊胃,每组随机选取15只斯氏按蚊进行解剖,测定蚊胃中卵囊的数量。10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组,每组5只,重复2次实验。每鼠尾静脉注射1×103个子孢子,每隔12 h取血,涂片观察其原虫血症出现时间。结果Py PK9与Pf PK9的序列一致性为82.5%, Py PK9和人类蛋白激酶p78的一致性为39.4%。PK9基因PCR扩增产物的长度约为597 bp。经PCR鉴定、测序确定PK9KO重组质粒构建成功, Py17XL虫株成功敲除PK9基因。WT感染组小鼠迅速出现原虫血症,感染后5~6 d全部死亡, PK9KO感染组小鼠全部存活,原虫血症在感染后17 d消失。WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组的斯氏按蚊感染率分别为60.0%(9/15)和66.7%(10/15),差异无统计学意义(P> 0.05)。WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组小鼠均于72 h查见原虫血症。结论PK9在红内期Py17XL的毒力中发挥了重要作用。

影响按蚊吸血行为的相关因素研究

目的有效阻止蚊虫的叮咬是预防蚊虫传播类疾病的重要手段,本研究旨在较系统地观察影响按蚊吸血行为的相关因素。方法首先确定按蚊50%吸血率并作为评判按蚊吸血效率的标准;然后系统观察环境温度、时间周期、蚊龄、鼠龄以及疟原虫感染等因素对按蚊吸血效率的影响。结果按蚊完成50%吸血率的时间为7.8min,饥饿状态和早期蚊龄(2-8日蚊)是促进按蚊吸血的自身因素;相对低温(21℃)和夜间时段(20时-凌晨2时)是利于按蚊吸血的环境因素,幼鼠和疟原虫感染的小鼠是提高按蚊吸血的宿主因素,其中疟原虫、宿主的贫血和体温变化并非促进按蚊吸血的直接因素。结论影响按蚊叮咬宿主的因素较为复杂,不但受按蚊饥饿状态、蚊龄等内在因素的影响,而且还受外界温度、时间节律、鼠龄及其感染状况的影响。这可为有效预防蚊虫叮咬措施的制定提供重要的理论和实验依据。

约氏疟原虫血淋巴子孢子诱导斯氏按蚊免疫基因分析

目的对约氏疟原虫感染后8、11和14 d的斯氏按蚊进行转录组测序,分析约氏疟原虫血淋巴子孢子诱导斯氏按蚊的免疫信号通路及效应机制。方法约氏疟原虫BY265株按常规腹腔接种感染健康昆明小鼠,3 d后选择血液内有配子体的小鼠供斯氏按蚊雌蚊吸血,于吸血感染后8、11和14 d各取斯氏按蚊20只,提取总RNA进行高通量转录组测序,分析按蚊基因表达情况;使用统计算法Bray Curtis进行层级聚类,分析各样本间基因表达的差异;根据每百万转录本(TPM)值进行差异基因分析;使用gplots package软件绘制聚类热图,分析感染后8、11和14 d,Toll信号通路(Toll)、免疫缺陷信号通路(Imd)、信号转导和转录激活因子(STAT)和c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)通路,效应分子如含硫酯蛋白家族分子(TEP)、抗菌肽、一氧化氮合酶(NOS)、硝化反应相关分子等的表达情况;利用实时荧光定量PCR(qPCR)扩增Rel1、Rel2转录因子、含硫脂蛋白分子(TEP1)和血红素过氧化物酶(HPX8)进行验证。结果层级聚类分析显示,斯氏按蚊感染后11 d与8 d和14 d的基因表达变化差异较大。差异基因分析结果显示,斯氏按蚊感染后11 d与8 d相比,有1109个基因上调,257个基因下调;感染后14 d与8 d相比,有62个基因上调,136个基因下调;感染后14 d与11 d相比,有174个基因上调,196个基因下调。聚类热图分析结果显示,在感染后11 d与8 d和14 d的比较中,斯氏按蚊Rel1转录因子、Toll5A和Toll1A受体分别上调约1.9、1.8和2.1倍;双过氧化物酶和双氧化酶均上调约2倍;HPX8上调约1.5倍。qPCR验证结果显示,感染后11 d Rel1、Rel2和HPX8的相对表达量为3.43、3.95和4.01,与对照组的0.82、0.88和1.01差异有统计学意义(P<0.01)。结论约氏疟原虫血淋巴子孢子可诱导斯氏按蚊Toll信号通路通过直接或协调其他通路调控硝化反应相关分子表达。