原创性疫苗研发案例用于药学专业学位硕士研究生“生物技术制药”课程教学实践

目的探索培养应用型生物技术制药专业人才的案例教学模式。方法以学校2018年至2022年选修“生物技术制药”课程的药学专业学位硕士研究生为研究对象,基于药学专业人才培养要求,制订该课程的教学目标。以教研室原创性疫苗研发为主要教学内容,综合运用基于问题的学习(PBL)法、案例教学法、研讨式教学法授课,在产学研平台落实以创新思维为导向的实践教学,过程性评价学生的学习效果。结果该教学实践有效提升了教学效果,培养了学生的创新运用理论解决实际问题的思维能力,其中有5名药学专业学位硕士研究生参与教研室原创性疫苗研发。结论基于原创性疫苗研发的案例教学课可用于药学专业学位硕士研究生“生物技术制药”课程教学。

基于药物研发能力导向的《生物技术制药》课程教学模式研究

目的培养高素质的生物技术制药创新型专业人才。方法开展以药物研发能力为导向的《生物技术制药》课程教学模式改革研究,具体方法包括形成以药物研发为主线的章节教学、构建以生物制药研发为引导的案例教学、开展以生物制药研发热点为主题的研讨教学、落实以鼓励创新为核心的实践教学,以及完善以生物制药创新思维为侧重的考核形式等。结果提高了课程教学质量,培养了学生的新药创新思维。结论以药物研发能力为导向的《生物技术制药》课程教学改革为培养生物技术制药领域创新型人才奠定了基础。

国家虚拟仿真实验教学课程共享平台用于“生物技术制药”课程实验教学实践

目的提升“生物技术制药”课程的实验教学效果。方法以中国人民解放军陆军军医大学2020级药学专业四年制本科生为授课对象,随机分为线上线下混合组(观察组)和线下组(对照组)。以生物技术制药经典实验为例,对照组采用传统方式教学;观察组由教师通过国家虚拟仿真实验教学课程共享平台中浙江中医药大学相应内容虚拟实验课程,进行虚拟仿真实验教学辅助传统线下教学。比较两组的学习效果。结果观察组学生均认为线上学习方式降低了自身学习难度,提高了兴趣,增强了掌握实验技能的自信。每个实验的观察组学生教学当天即可完成教学过程,短于对照组实验使用时间。观察组学生实验课平均得分为(93.78±1.41)分,明显高于对照组的(75.94±0.00)分(P<0.05)。结论虚拟仿真实验教学作为“生物技术制药”课程课堂教学辅助手段,可有效解决传统实验课程面临的学时有限、操作机会有限、教学效果欠佳的难题,助力生物技术制药专业人才实际操作技能的培养。

《生物技术制药》课程思政设计与实践探索

目的促进药学专业学生的知识与德育协调发展,实现德才兼备、以德为先的培养目标。方法对药学专业核心课程《生物技术制药》进行思政设计,从正反案例、中华传统文化、道德与伦理等方面深入挖掘各章节知识点的思政元素。结果《生物技术制药》的思政元素包括文化传承精神,职业精神,遵守法律法规,创新精神,直面困难、坚持科学精神等。通过基因工程制药、动物细胞工程制药、抗体工程制药、酶工程制药、发酵工程制药、蛋白质工程制药等核心章节,设计各章节思政元素的案例和设置点位。带教实践中,树立全员、全过程的《生物技术制药》课程思政新理念,结合背景知识及社会热点将课程教学与爱国主义融合,利用专业知识点背后的经典人文故事将课程教学与职业使命有机联系,以身边典型案例升华思政教学。结论《生物技术制药》课程的思政设计可实现知识传授、价值引导和能力培养的有机统一,培养出有品德、有能力、有责任的高素质药学人才。

新型NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统的构建、优化及其增强MRSA重组亚单位疫苗的免疫保护效应研究

目的 以具有自主知识产权的纳米乳(NEA)和商品化的氢氧化铝[Al(OH)_(3)]作为配方组分,制备出新型NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统,并对增强MRSA重组亚单位疫苗免疫应答效应的作用进行研究。方法 以血清特异性IgG作为评价指标,将2种乳剂(NEA和MF59)和2种铝盐[Al(OH)_(3)和AlPO4]进行复配筛选;采用多因素实验设计,对初步筛选出的复合佐剂成分进行三因素三水平正交实验,确定优选的NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统处方;采用金黄色葡萄球菌国际标准株(MRSA252)建立Balb/c小鼠脓毒血症动物感染致死模型,进一步对新型NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统增强MRSA重组亚单位疫苗抗原HI的免疫应答效应(特异性体液免疫应答、细胞免疫应答、免疫保护效力)进行比较研究,评价其免疫增强的保护效果及初步机制。结果 NEA和Al(OH)_(3)的复配是优选的乳剂与铝盐复合佐剂组分;通过三因素三水平正交实验确定优化的NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统处方为:HI抗原量60μg、佐剂量200μg、NEA与Al(OH)_(3)的配比为2:8(w/w);脓毒血症动物模型攻毒保护的研究结果表明:基于新型NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统的MRSA重组亚单位疫苗可于首次免疫后第7天即产生特异性免疫应答,特异性IgG抗体效价最高可达1:143 360,同时诱导出高水平的特异性细胞免疫应答(IL-12P40、INF-γ),LD90的攻毒保护率为80%,具有优于单一佐剂组的良好免疫原性及保护效果。结论 成功优选制备的新型NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统可有效增强MRSA重组亚单位疫苗的免疫应答水平和保护效力,为新型复合佐剂在重组蛋白疫苗中的应用与开发提供了重要的实验基础。

基于自媒体平台的药学类专业研究生培养模式探索

目的优化药学类专业研究生的培养模式。方法根据药学类专业研究生培养的实际情况,以加强学术道德思想建设、拓宽研究生学术思维、提高实验技术水平、促进学术交流等为着力点,将以微信为代表的自媒体平台运用到其中。通过问卷调查的形式调查学校药学类专业13名研究生,评估相比于传统的科研讨论学习方法,研究生对自媒体形式的满意度和实际需求情况,以及该自媒体平台用于研究生教学的效果。结果共发放调查问卷13份,收回13份;9人(69. 23%)对以微信公众号为主的自媒体平台开展科研工作感兴趣,4人(30. 77%)很感兴趣;8人(61. 54%)会仔细阅读公众号推送的科研文献、科学前沿报告;9人(69. 23%)认为"实验操作"板块中所发布的实验操作手册和视频对日常科研十分有帮助;4人(30. 77%)认为此微信公众号用于学术交流有一定必要,9人(69. 23%)认为十分必要。结论以微信为代表的自媒体平台提高了药学类专业研究生的科研与实践创新能力,增强了其综合素养,为研究生的培养提供了新思路。

基于单个外周血浆细胞技术筛选MRSA人源性单克隆抗体的实验研究

目的建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)人源性单克隆抗体筛选方法。方法从52份重组MRSA多价亚单位疫苗的Ⅰ期临床研究受试者血液样本中筛选出抗体滴度高的血样,利用流式细胞术分选其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中浆细胞,以mRNA为模板PCR扩增抗体重链、轻链可变区基因,通过重叠延伸PCR分别将将抗体重链、轻链可变区基因与CMV启动子、人恒定区及多聚A尾连接,构建成单克隆抗体线性表达载体,PEI瞬时转染293T细胞进行抗体表达。结果流式细胞术分选出1 120个浆细胞,筛选出了39个针对MRSA 5种保护性抗原α-溶血素(Hla)、铁离子表面决定蛋白B(Isd B)、金葡菌蛋白A(SpA 5)、肠毒素B(SEB)及锰离子结合蛋白C(Mnt C)的人源性单克隆抗体,ELISA结果显示抗体能与抗原蛋白结合。结论通过单个外周血浆细胞技术,成功筛选出了能够与抗原结合的MRSA人源性单克隆抗体,为研究MRSA治疗性人源性抗体奠定了良好基础。

重组金黄色葡萄球菌疫苗免疫血清中功能性抗体OPK检测方法的建立

目的建立重组金黄色葡萄球菌疫苗免疫血清中功能性抗体检测方法。方法在参考美国阿拉巴马大学的多重调理吞噬实验(UAB-MOPA)方法的基础上,构建并鉴定HL-60效应细胞库及金黄色葡萄球菌工作种子批,完成补体浓度、调理和吞噬孵育时间及血清预稀释倍数等关键实验参数的优选。在此基础上对5种不同来源金黄色葡萄球菌进行调理吞噬杀菌(OPK)活性的检测。结果 HL-60细胞经0.8%DMF诱导分化4 d后,CD35表达量为87.1%,CD71表达量为2.82%,活细胞比例为75.7%;靶细菌工作种子批冻存复活率>90%,工作稀释度>1 000;体系中补体终浓度确定为6%;选择30 min、60 min作为调理和吞噬孵育时间;血清预稀释倍数为2倍;疫苗免疫血清对5种不同来源的金黄色葡萄球菌均表现出良好的OPK活性及标准的"S"型杀菌曲线。结论本研究优化建立的OPK检测方法,可有效评价重组金黄色葡萄球菌疫苗的体外功能性抗体水平,为疫苗临床试验样本检测及免疫有效性替代终点的确立提供了重要的技术支撑。

新冠病毒DNA疫苗的研究现状及展望

全球新冠病毒的流行对社会生产和人民生活都带来了严重的不利影响。疫苗是控制新冠病毒传播的有力武器,其中DNA疫苗具有安全、高成本效益以及易于生产的特点,更重要的是其可以诱导机体产生免疫应答并阻断病毒感染。本文综述了已进入临床试验以及在临床前研究的新冠病毒DNA疫苗,并对其作用特点以及保护效果进行了分析。

不同免疫方式对新冠DNA疫苗应答效果的影响

目的探究气管灌注和电脉冲肌肉导入2种免疫方式对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)DNA疫苗免疫应答的影响。方法利用真核表达载体pVAX-1,设计并构建p RBD、p S-2P和p S-2P.3513种SARS-CoV-2 DNA疫苗。在第0、2和4周采用气管灌注以及电脉冲肌肉导入2种方式免疫小鼠。末次免疫后2周,ELISA检测血清及阴道灌洗液特异性IgG抗体水平,肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)、鼻腔灌洗液(nasal solution,NS)以及阴道灌洗液(vaginal wash)特异性sIgA抗体水平;ELISpot检测免疫后小鼠脾细胞分泌特异性IFN-gamma的水平。结果气管灌注及电脉冲肌肉导入2种方式免疫SARS-CoV-2DNA疫苗,仅气管灌注免疫可诱导特异性呼吸道黏膜sIgA应答,而电脉冲肌肉导入诱导了更强的细胞免疫应答。与气管灌注pRBD相比,气管灌注pS-2P和p S-2P.351可诱导更强的黏膜免疫应答和细胞免疫应答。结论气管灌注和电脉冲肌肉导入2种免疫方式均可诱导特异性体液免疫以及细胞免疫应答,电脉冲肌肉导入诱导了更强的细胞免疫应答,而气管灌注在诱导呼吸道黏膜免疫应答方面更具优势。

印苦楝内酯靶向RNF114治疗金黄色葡萄球菌急性肺炎

目的探究印苦楝内酯(nimbolide,NIM)治疗金黄色葡萄球菌急性肺炎作用机制。方法通过气管插管构建小鼠金葡菌急性肺炎模型,NIM治疗后,观察小鼠生存率差异,平板培养分析肺部荷菌量变化,ELISA检测肺组织炎性细胞因子表达差异;ELISA及Western Blot检测腹腔原代巨噬细胞感染金葡菌后,NIM对炎症细胞因子的表达水平及炎症通路激活的影响;慢病毒shRNA敲低原代腹腔巨噬细胞RNF114蛋白水平,通过ELISA及Western Blot探究NIM是否通过RNF114抑制炎症反应。结果金葡菌感染小鼠肺部后可导致急性死亡,NIM显著提高了小鼠生存率,下调小鼠肺部炎症细胞因子水平,但短期内不影响金葡菌肺部定植;巨噬细胞感染结果表明,NIM可能通过调控RNF114功能,下调ERK的磷酸化水平抑制MAPK通路激活,进而抑制炎症细胞因子的表达。结论NIM可能通过调控巨噬细胞RNF114功能,抑制MAPK通路激活进而抑制小鼠肺部炎症细胞因子的表达,最终抑制金葡菌急性肺部高炎症导致的小鼠死亡。

鲍曼不动杆菌外膜蛋白疫苗的制备及其保护作用评价

目的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,Ab)的感染及广泛耐药是临床防治的一大难题,国际上Ab疫苗的研制尚未成功,本研究旨在开发新型Ab候选疫苗预防其感染。方法本研究使用脱氧胆酸钠法制备鲍曼不动杆菌外膜蛋白(out membrane protein,OMP)疫苗,命名为Ab dOMP疫苗,并通过透射电镜(TEM)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)对其进行表征,构建Ab感染致死模型评价疫苗的保护效果,并作免疫应答机制分析。结果Ab dOMP疫苗滴鼻免疫的保护率为71.43%(P<0.05),显著高于肌注组(保护率为28.57%)。疫苗免疫可诱导显著的血清特异性IgG应答,且与肌注免疫相比,滴鼻免疫还可以诱导高水平的特异性sIgA。Ab dOMP疫苗可以显著刺激BMDCs表面成熟标志CD40、CD80和CD86表达上调,以及促进细胞因子TNF-α、IL-12p70、IL-10、IL-6和IL-1β的分泌。结论Ab dOMP疫苗对鲍曼不动杆菌感染具有良好的保护作用,且滴鼻免疫的保护效果优于肌注免疫。

全反式维甲酸纳米乳的制备及其疫苗佐剂效应评价

目的制备装载全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)的纳米乳佐剂,评价其黏膜佐剂效应。方法使用低能乳化法制备包裹有维甲酸的纳米乳,利用动态光散射仪、扫描电子显微镜、透射电子显微镜等对其理化性质进行表征;与BMDCs、脾淋巴细胞或肠系膜淋巴结细胞共孵育后用流式细胞术检测其促淋巴细胞成熟和分化的能力;小鼠肌注给药后,表征其诱发注射部位急性炎症情况;ELISA检测脾淋巴细胞分泌IL-4、IL-17A等细胞因子的表达水平以及血清与肠黏膜部位抗原特异性抗体的滴度,初步评价维甲酸纳米乳作为黏膜疫苗佐剂的效应。结果成功制备了平均粒径27.23 nm,Zeta电位-25.8 mV,装载0.998 mg/ml全反式维甲酸的纳米乳,与抗原物理混合后通过肌肉注射免疫小鼠,在注射部位诱导了与铝佐剂相当的IL-6与IL-15的水平,形成了有利于免疫响应的炎症微环境,在诱导高水平血清抗原特异性IgG的同时,在肠黏膜部位还诱导了高水平的抗原特异性sIgA抗体。结论维甲酸纳米乳具有良好的黏膜佐剂活性,肌肉注射后可激活体液与肠黏膜抗原特异性抗体应答,为后续研究通过肠道入侵人体病原体的疫苗提供新思路。

天然细菌脂肽的提取及其佐剂活性评价

目的提取、分离部分天然细菌脂肽,系统考察天然细菌脂肽的佐剂活性。方法选取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)和变形链球菌(Streptococcus mutans)共6种临床常见的致病菌,经过接种、发酵、酸沉、醇提和旋蒸等操作,获得6种细菌的天然脂肽。通过肌注和滴鼻2种免疫方式,系统评价了所提取的6种细菌的天然脂肽对模式抗原卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的佐剂作用。结果化脓性链球菌脂肽联合OVA肌注或滴鼻免疫小鼠能显著提高特异性IgG抗体效价,表现出与铝佐剂和LTK63的相当的体液免疫刺激作用;铜绿假单胞菌脂肽2种免疫方式所诱导的血清IgG2a抗体水平要显著高于铝佐剂和LTK63,并提示可以诱导细胞免疫应答由Th2型向Th1型方向偏移;表皮葡萄球菌脂肽则在2种免疫方式中表现出显著的IL-17表达的诱导作用。结论天然细菌脂肽具有良好的佐剂活性,为天然细菌脂肽佐剂筛选和后续分离纯化提供了思路。

吸入性疫苗递送研究进展

呼吸道是病原体感染最常见部位,也是诱导机体保护性免疫应答的重要场所。吸入性疫苗不仅能诱导黏膜局部产生抗原特异性免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA),而且能激发全身性IgG抗体和局部呼吸道的细胞免疫应答。但由于缺乏有效的递送系统,使吸入性疫苗的研发进展缓慢。近年来,基于微粒的递送系统为吸入性疫苗的设计提供了新的思路,经合理设计后获得最佳理化特性的微粒疫苗不仅能防止抗原被酶降解,而且能靶向抗原递呈细胞,从而产生长期、有效的保护性免疫应答。目前吸入性流感疫苗Flumist已在国内外获批上市,2022年,我国批准全球首款吸入式新冠疫苗紧急使用,此外,还有大量吸入性疫苗已开始临床试验。本文就近年来吸入性疫苗递送的研究进展作一简要综述。