新型NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统的构建、优化及其增强MRSA重组亚单位疫苗的免疫保护效应研究

目的 以具有自主知识产权的纳米乳(NEA)和商品化的氢氧化铝[Al(OH)_(3)]作为配方组分,制备出新型NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统,并对增强MRSA重组亚单位疫苗免疫应答效应的作用进行研究。方法 以血清特异性IgG作为评价指标,将2种乳剂(NEA和MF59)和2种铝盐[Al(OH)_(3)和AlPO4]进行复配筛选;采用多因素实验设计,对初步筛选出的复合佐剂成分进行三因素三水平正交实验,确定优选的NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统处方;采用金黄色葡萄球菌国际标准株(MRSA252)建立Balb/c小鼠脓毒血症动物感染致死模型,进一步对新型NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统增强MRSA重组亚单位疫苗抗原HI的免疫应答效应(特异性体液免疫应答、细胞免疫应答、免疫保护效力)进行比较研究,评价其免疫增强的保护效果及初步机制。结果 NEA和Al(OH)_(3)的复配是优选的乳剂与铝盐复合佐剂组分;通过三因素三水平正交实验确定优化的NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统处方为:HI抗原量60μg、佐剂量200μg、NEA与Al(OH)_(3)的配比为2:8(w/w);脓毒血症动物模型攻毒保护的研究结果表明:基于新型NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统的MRSA重组亚单位疫苗可于首次免疫后第7天即产生特异性免疫应答,特异性IgG抗体效价最高可达1:143 360,同时诱导出高水平的特异性细胞免疫应答(IL-12P40、INF-γ),LD90的攻毒保护率为80%,具有优于单一佐剂组的良好免疫原性及保护效果。结论 成功优选制备的新型NEA/Al(OH)_(3)复合佐剂系统可有效增强MRSA重组亚单位疫苗的免疫应答水平和保护效力,为新型复合佐剂在重组蛋白疫苗中的应用与开发提供了重要的实验基础。

基于单个外周血浆细胞技术筛选MRSA人源性单克隆抗体的实验研究

目的建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)人源性单克隆抗体筛选方法。方法从52份重组MRSA多价亚单位疫苗的Ⅰ期临床研究受试者血液样本中筛选出抗体滴度高的血样,利用流式细胞术分选其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中浆细胞,以mRNA为模板PCR扩增抗体重链、轻链可变区基因,通过重叠延伸PCR分别将将抗体重链、轻链可变区基因与CMV启动子、人恒定区及多聚A尾连接,构建成单克隆抗体线性表达载体,PEI瞬时转染293T细胞进行抗体表达。结果流式细胞术分选出1 120个浆细胞,筛选出了39个针对MRSA 5种保护性抗原α-溶血素(Hla)、铁离子表面决定蛋白B(Isd B)、金葡菌蛋白A(SpA 5)、肠毒素B(SEB)及锰离子结合蛋白C(Mnt C)的人源性单克隆抗体,ELISA结果显示抗体能与抗原蛋白结合。结论通过单个外周血浆细胞技术,成功筛选出了能够与抗原结合的MRSA人源性单克隆抗体,为研究MRSA治疗性人源性抗体奠定了良好基础。

藤黄属药用植物活性成分的药理作用及其机制研究新进展

近年来,由于藤黄属活性成分具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等众多药理作用的独特优点而受到研究者广泛关注。藤黄属植物(Garcinia Linn.)所分泌的干燥胶树脂,其化学成分主要有桥环类环氧杂蒽酮、糖、黄酮、三萜等,其活性成分包括藤黄酸、新藤黄酸、α、β-藤黄素,藤黄宁和别藤黄酸等。本文对其抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理活性及其作用机制进行较为系统综述,期望为更好地利用与开发藤黄属药用植物奠定坚实基础。

重组金黄色葡萄球菌疫苗免疫血清中功能性抗体OPK检测方法的建立

目的建立重组金黄色葡萄球菌疫苗免疫血清中功能性抗体检测方法。方法在参考美国阿拉巴马大学的多重调理吞噬实验(UAB-MOPA)方法的基础上,构建并鉴定HL-60效应细胞库及金黄色葡萄球菌工作种子批,完成补体浓度、调理和吞噬孵育时间及血清预稀释倍数等关键实验参数的优选。在此基础上对5种不同来源金黄色葡萄球菌进行调理吞噬杀菌(OPK)活性的检测。结果 HL-60细胞经0.8%DMF诱导分化4 d后,CD35表达量为87.1%,CD71表达量为2.82%,活细胞比例为75.7%;靶细菌工作种子批冻存复活率>90%,工作稀释度>1 000;体系中补体终浓度确定为6%;选择30 min、60 min作为调理和吞噬孵育时间;血清预稀释倍数为2倍;疫苗免疫血清对5种不同来源的金黄色葡萄球菌均表现出良好的OPK活性及标准的"S"型杀菌曲线。结论本研究优化建立的OPK检测方法,可有效评价重组金黄色葡萄球菌疫苗的体外功能性抗体水平,为疫苗临床试验样本检测及免疫有效性替代终点的确立提供了重要的技术支撑。

天然源性佐剂在肿瘤疫苗中的应用进展与未来发展趋势

肿瘤已成为导致死亡的主要原因,而肿瘤疫苗可增强患者免疫应答,成为治疗和预防的重要手段。然而肿瘤疫苗大部分为重组亚单位蛋白抗原,免疫原性差,难在免疫系统受损的患者中诱导强烈的免疫应答,从而影响肿瘤疫苗上市批准。疫苗中的核心成分佐剂可极大增强机体免疫应答的强度、速度和持续时间,从而成为开发理想肿瘤疫苗的关键所在。现大多肿瘤疫苗采用传统铝、MF59和AS系列等佐剂,且产品和专利均被国外大型公司垄断。我们对新型佐剂的长期研究发现,天然源性佐剂具有众多独特的优势,如具有来源广泛,生物相容性好,可促进树突状细胞的成熟和免疫细胞因子的分泌,显著增强肿瘤疫苗免疫应答等。本文对天然源性多糖、皂苷、黄酮类化合物、植物病毒样颗粒等重要佐剂在肿瘤疫苗中的应用及其未来发展方向进行综述,期望能为开发出具有我国自主知识产权的新型原创型疫苗佐剂奠定科学的理论基础。