组织工程骨募集宿主间充质干细胞参与骨重建的机制研究

目的探讨创伤后骨缺损组织工程骨（TEB）移植后，组织工程骨募集宿主骨髓间充质干细胞（BMSCs）参与骨重建的机制。方法体内实验：取8周龄FVB／N小鼠，切除股骨干中部2mm骨干和骨膜，制作大段骨缺损。缺损处分别植入脱钙骨基质（DBM）和TEB并固定，所有小鼠按随机数字表法分为DBM组（18只）和TEB组（18只）。移植后24h流式细胞术评价宿主BMSCs入血的数量，活体动物体内成像观察两组募集循环中小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）到达损伤区域的能力，ELISA法比较两组外周血中基质细胞衍生因子-1（SDF-1）含量。体外实验：（1）迁移小室实验评估SDF-1（100ng／m1）促进人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）迁移的能力，SDF-1／趋化因子受体4（CXCR4）通路通过选择性CXCR4拮抗剂普乐沙福（AMD3100）阻断，按处理因素分为对照组、SDF-1组和SDF-1＋AMD3100组。（2）建立人脐静脉内皮细胞（hUVECs）、hBMSCs共培养体系并通过SDF-1刺激细胞，按共培养细胞和处理因素分为hBMSCs组、hBMSCs＋hUVECs组和hBMSCs＋hUVECs（AMD3100预处理）组。迁移小室实验比较各组hBMSCs迁移数量，ELISA法检测共培养上清的肝细胞生长因子（HGF）水平。（3）对体外培养的hUVECs分别通过SDF-1刺激以及AMD3100拮抗SDF-1／CXCR4，按处理因素分为对照组、SDF-1组和SDF-1＋AMD3100组，实时荧光定量PCR（qRT—PCR）评价各组HGF表达。结果体内实验：骨缺损材料移植后24h，TEB组外周血中间充质干细胞（MSCs）数量、SDF-1浓度与DBM组比较均有明显增高（P〈0．05），TEB组募集的术后注射进入循环的mBMSCs多于DBM组（P〈0．01）。体外实验：（1）单种细胞迁移小室实验中，相比对照组和SDF-1＋AMD3100组，SDF-1组显著增强hBMSCs迁移能力（P〈0．01）。（2）hBMSCs和hUVECs共培养体系迁移小室实验中，与hBMSCs组、hBMSCs＋hUVECs（AMD3100预处理）组比较，hBMSCs＋hUVEC组迁移细胞数量和HGF浓度均显著增多（P〈0．01），而hBMSCs组与hBMSCs＋hUVECs（AMD3100预处理）组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。（3）qRT—PCR显示，与对照组比较，SDF-1组HGF表达明显升高（P〈0．01）。拮抗SDF-1／CXCR4后，SDF-1＋AMD3100组HGF表达与SDF-1组比较显著降低（P〈0．05）。结论骨缺损TEB移植后可以显著提高体内趋化因子SDF-1水平，有效促进宿主MSCs的动员和循环中MSCs的募集。SDF—1不仅通过SDF-1／CXCR4直接促进hBMSCs的迁移，还可上调血管细胞HGF的表达和分泌，进一步放大SDF-1对hBMSCs的趋化作用。