铁皮石斛谷氨酸脱羧酶基因的分离与生物信息学分析

目的分离珍稀濒危兰科药用铁皮石斛谷氨酸脱羧酶（GAD）基因并进行生物信息学和表达分析。方法采用 RT-PCR和 RACE技术获基因 cDNA全长；利用生物信息学软件分析蛋白理化性质、结构域和三维建模等分子特性；用 DNASTAR 6.0和 MEGA 4.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树分析；借助实时定量 PCR检测基因表达。结果分离到DoGAD基因，cDNA全长1795 bp，编码一条由498个氨基酸组成的多肽，分子量55.90 kD，等电点5.32；DoGAD蛋白不含跨膜域或信号肽，具有谷氨酸脱羧酶和磷酸吡哆醛依赖的脱羧酶结构域（17-443、37-381）；DoGAD与植物 GADs蛋白一致性为69.5%~78.8%，隶属于 GADs分子进化树的植物类群；DoGAD转录本在石斛叶和茎中相对表达量较高，分别为根中的5.16和3.92倍。结论成功克隆得到铁皮石斛谷氨酸脱羧酶基因全长， DoGAD 的表达特征暗示其可能在铁皮石斛叶和茎中发挥重要的调控作用。

第二代HIV-1整合酶抑制剂筛选靶点概述

HIV-1整合酶是病毒复制所必需的酶。在临床上，使用HIV-1整合酶（integrase，IN）抑制剂来治疗HIV感染被证明是非常有益的。目前，FDA批准上市的第一个HIV-1整合酶抑制剂raltegravir已作为一线药物用于临床。

铁皮石斛鲨烯合酶基因的克隆及其组织表达模式分析

【目的】克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）鲨烯合酶（Squalenesynthase，SS）基因（DoSS），并对其进行生物信息学与组织表达模式分析，为研究其生物学功能提供参考。【方法】采用RT—PCR和RACE技术，获得DoSS基因全长序列；利用生物信息学软件预测DoSS蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性；用DNASTAR6．0和MEGA4．0分别进行DoSS蛋白氨基酸多序列比对和进化关系分析；借助qPCR检测DoSS基因的组织表达模式。【结果】成功克隆获得铁皮石斛鲨烯合酶基因，命名为DoSS（GenBank注册号JX272631），其cDNA全长1735bp，编码一条由410个氨基酸组成的多肽，分子质量46．99ku，等电点7．13；DoSS蛋白含有鲨烯／八氢番茄红素合成酶保守结构域（44—315位氨基酸）；DoSS与其他多种植物SS基因的编码蛋白同源性很高（61％～75％），与水稻、玉米等单子叶植物的亲缘关系较近；DoSS基因为组成型表达，在根中的表达量最大，为叶的12．41倍；茎次之，为叶的1．87倍。【结论】成功克隆得到1个鲨烯合酶基因（DoSS）全长cDNA；DoSS基因的（在根中高）表达特征暗示，其可能在铁皮石斛根的生长发育中发挥重的调控功能。

铁皮石斛类唾液酸转移酶基因的分子鉴定

利用RT-PCR和RACE技术,从珍稀濒危药用植物铁皮石斛(Dendrobium officinale)中分离到一个类唾液酸转移酶(sialyltransferase-like proteins,STLP)基因,命名为DoSTLP1(GenBank注册号KC178574)。序列分析结果表明,DoSTLP1基因全长cDNA为1 340bp,编码1条由367个氨基酸组成的肽链,分子量41.66kD,等电点8.64;DoSTLP1蛋白具有唾液酸转移酶和糖基转移酶29家族的保守结构域(分别为1～357,87～346位氨基酸)、信号肽(1～27)和跨膜结构域(3～25,285～311)。多序列比对和系统进化结果显示,DoSTLP1与多种植物的STLPs基因有较高的相似性(44.7%～53.7%),而且与水稻、玉米等单子叶植物STLPs基因的亲缘关系较近。实时定量PCR分析显示,DoSTLP1基因在铁皮石斛根、茎、叶器官中为组成型表达,其转录本在石斛根中的相对表达量较高,为叶中的2.857倍,茎和叶中的表达量无显著差异。该研究为进一步解析该基因在铁皮石斛生长发育过程中的生物学功能奠定基础。

铁皮石斛促分裂原活化蛋白激酶基因DoMPK1的克隆及特征分析

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)及其级联途径在根瘤、从枝菌根宿主植物共生体系中起重要调控作用。然而,MAPK在兰科菌根共生体系中的作用机制尚不明确。本研究利用RT-PCR、RACE方法,首次从小菇真菌(Mycena sp.)侵染的铁皮石斛根中克隆到一个促分裂原活化蛋白激酶基因,命名为DoMPK1(GenBank注册号JX297594)。DoMPK1基因cDNA全长1 632 bp,编码一条由372个氨基酸组成的肽链,分子量42.61 kD,等电点6.07。DoMPK1蛋白包含MAPK蛋白家族保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(39 325)和MAP激酶的保守位点(77-177)。DoMPK1与多种植物MAPK基因高度同源(71%～85%),与单子叶植物MAPK基因亲缘关系较近。DoMPK1为组成型表达,其转录本在石斛根、茎、叶和种子等4种组织中的相对表达量差异不显著。在小菇真菌侵染30天的根中,DoMPK1显著上调,为对照根中的7.91倍,表明DoMPK1可能在小菇真菌铁皮石斛菌根共生早期互作过程中起作用。本研究为进一步解析DoMPK1在小菇真菌铁皮石斛菌根共生中的分子作用奠定基础。

一个受菌根真菌诱导的铁皮石斛钙依赖蛋白激酶基因的克隆及表达分析

钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs)在从枝菌根、根瘤菌-宿主植物共生体系中起重要调控作用。然而,CDPKs在兰科菌根共生体系中的作用机制尚不清楚。本研究利用RT-PCR、RACE方法,首次从小菇真菌(Mycena sp.)侵染的铁皮石斛根中克隆到1个钙依赖蛋白激酶基因,命名为DoCPK1(GenBank注册号JX193703)。DoCPK1全长2 137 bp,编码一条由534个氨基酸组成的肽链,分子量59.61 kD,等电点6.03。DoCPK1蛋白包含CDPKs蛋白家族保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域和4个Ca2+结合的EF-hand基元。DoCPK1与人参PgCPK1(ACY78680)同源性最高(85%),小麦、水稻、拟南芥CDPKs基因(ABD98803,ADM14342,Q9ZSA2)等次之,与单子叶植物CDPKs基因亲缘关系最近。DoCPK1为组成型表达,其转录本在各器官中相对表达量依次为根>茎>种子>叶。在小菇真菌侵染30 d的石斛根中,DoCPK1显著上调,为对照根中的5.16倍,表明DoCPK1参与小菇真菌-铁皮石斛菌根早期互作,可能在该共生体系中起作用。本研究为进一步阐明DoCPK1在小菇真菌-铁皮石斛菌根共生中的潜在功能奠定基础。