SV40-LT基因使牙髓干细胞永生化的研究

目的:分离牙髓干细胞,用含有SV40-LT抗原的慢病毒感染牙髓干细胞以建立永生化细胞株并进行鉴定。方法:消化法获得牙髓干细胞;用慢病毒粒子HBLV-SV40LT-3*flag-PURO感染目的细胞,抗生素筛选出稳定传代的细胞株,并进行干性测定。结果:原代与永生化的牙髓干细胞(iDPSCs)在分化能力及表面标记物的检测无差异;Real-time PCR结果显示,感染组细胞中SV40-LT基因的转录水平显著提高;Western blot结果显示,实验组均可检测到标签蛋白Flag的表达。结论:含有SV40-LT基因片段的慢病毒可使人牙髓干细胞发生永生化,永生化后的细胞仍具有多向分化潜能。

新化合物Elixir-X对肝切及辐射所致衰老小鼠的抗衰老作用

目的探讨蜂巢提取物Elixir-X对自然衰老及辐射衰老小鼠的影响,为Elixir-X的进一步研发提供药理学基础。方法采用小鼠肝脏切除术建立自然衰老小鼠模型,将其分为空白对照组、Elixir-X组、白藜芦醇组及模型组,连续给药7 d后,检测小鼠70%肝脏切除后的再生过程中,衰老细胞、肝脏功能恢复与肝脏再生的变化,观察Elixir-X对自然衰老的影响;采用^(60)CO辐射法建立辐射衰老小鼠模型,将其分为模型组、空白对照组、白藜芦醇组、Elixir-X高、低剂量组,通过检测小鼠肠隐窝干细胞再生、小肠绒毛结构以及衰老细胞的变化,对比不同剂量Elixir-X对辐射后衰老的影响。结果在肝脏切除术的小鼠模型中,Elixir-X组的肝功能水平明显低于模型组的肝脏自然再生小鼠,显著促进了肝功能恢复(P<0.05);同时与模型组相比,Elixir-X组清除了肝脏切除后再生过程中产生的衰老细胞(P<0.05),Ki-67的着色斑块明显增加,促进肝脏的再生,且肝血窦的扫描电镜影像结果中Elixir-X组肝血窦再生加快。^(60)CO辐照小鼠模型中,与模型组相比,Elixir-X组有效促进辐照后肝脏功能恢复(P<0.05),Elixir-X高剂量组体重也恢复到正常水平,与空白对照组无显著差异;与模型组相比,Elixir-X低剂量组小肠的β-Gal着色细胞减少,Elixir-X高剂量组甚至能更有效地减少衰老细胞(P<0.05);小肠HE染色的结果中,Elixir-X组小肠绒毛结构得到恢复;Ki-67的IHC染色中,与模型组相比,Elixir-X组着色板块更多,且着色区域都在肠隐窝干细胞位置。结论Elixir-X能有效清除肝脏切除术引起的自然衰老与辐射引起的损伤性衰老细胞,对衰老具有显著地抑制作用。

IL-17对人脐带间充质干细胞体外免疫调节特性的影响

目的:研究白细胞介素17(IL-17)对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的免疫调节能力的影响。方法:采用组织块贴壁法从健康足月胎儿脐带中分离培养hUC-MSCs,并对其进行鉴定。然后在培养基中加入不同浓度IL-17,采用EdU细胞增殖法检测hUC-MSCs增殖情况,流式细胞术(FCM)检测h UC-MSCs表面标记及细胞周期,RT-qPCR检测免疫调节相关基因表达水平,ELISA检测上清中免疫调节相关因子分泌水平,免疫学反应检测其免疫调节能力。结果:①倒置显微镜下观察可见hUC-MSCs呈现较均一漩涡状、梭形生长,细胞体积较小;细胞表面表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD19、CD11b、CD45、HLA-DR;具有成脂、成骨、成软骨诱导分化能力。②FCM检测结果显示IL-17处理后,hUC-MSCs免疫表型未发生变化,而IFN-γ处理后,hUC-MSCs表面标记HLA-DR表达明显上调。③与对照组相比,IL-17处理组的hUC-MSCs活性更好,且能促进细胞增殖。④与空白对照组相比,IL-17处理组h UC-MSCs的TGF-β、IL-10、IDO、PGE2、TSG-6、PD-L1基因表达均显著上调(P<0.001)。⑤ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,IL-17处理组上清中TGF-β、IL-10、IDO、PGE-2、TSG-6、PD-L1分泌水平明显增高(P<0.001)。⑥与空白对照组相比,IL-17处理组的CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、B细胞的比例降低,Treg细胞比例增高(P<0.001)。结论:IL-17在不影响hUC-MSCs免疫表型的条件下,可促进细胞增殖,上调免疫相关基因表达,提高TGF-β、IL-10、PGE-2、IDO、TSG-6、PD-L1分泌水平,增强hUC-MSC免疫调节能力。因此,本研究将为预处理的hUC-MSCs防治免疫炎症性疾病提供理论依据。

改良型无血清培养基对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察改良型无血清培养基对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)生物学特性的影响。方法采用组织块贴壁法从健康足月胎儿脐带中分离hUC-MSCs,用10%胎牛血清+DMEM/F12培养基(胎牛血清组)、MSCs无血清培养基(无血清1组)、OptiVitro MSC SFM-XF培养基(无血清2组)培养。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测免疫表型,诱导分化实验检测多向分化潜能,CCK-8法检测细胞增殖情况,免疫学反应检测淋巴细胞亚群。结果胎牛血清组细胞呈梭形,漩涡状生长;无血清1组细胞体积较小,短梭形,呈无规则生长;无血清2组细胞体积较小,短梭形,呈漩涡状生长。三组细胞均表达CD44、CD73、CD90和CD105,不表达CD34、CD19、CD11b、CD45、HLA-DR。三组细胞均具有成脂、成骨、成软骨诱导分化能力,且组间无统计学差异(P>0.05)。三组细胞生长曲线呈"S"形,无血清2组生长较快。三组CD3^+CD4^+T细胞、CD3^+CD8^+T细胞、B细胞、Treg细胞比例和TNF-α水平均无统计学差异(P>0.05)。结论改良型无血清培养基(OptiVitro MSCs SFM-XF培养基)培养的hUC-MSCs符合鉴定标准,且具有较高的增殖能力及细胞活性,可作为临床级hUC-MSCs培养的优选方案。