陕西历代小麦品种籽粒硬度演变规律研究

利用单籽粒谷物特性测试仪和PCR扩增方法对170余份陕西省历代和当代主要小麦品种(系)的籽粒硬度及基因Pina和Pinb等位变异进行了研究,以揭示陕西省小麦品种换代过程中籽粒硬度的演变规律。其中,历代品种(系)材料51份,硬质麦占39.22%,混合麦占60.78%;Pina-D1b等位基因类型为9.80%,Pinb-D1b等位变异类型为47.06%;当代小麦品种(系)119份,硬质麦占38.66%,混合麦占61.34%;Pina-D1b等位变异类型为17.65%,Pinb-D1b等位变异类型为39.50%;Pina基因所占比例为14.29%,Pinb基因所占比例为63.03%;陕西省历代小麦品种硬度平均数呈先降后升趋势,总体呈现逐渐上升。

小麦籽粒硬度研究进展

小麦籽粒硬度是当前小麦育种的主要目标之一,对小麦的制粉品质有重要影响,是小麦品质评价的重要指标之一。本文从小麦籽粒硬度测定方法、籽粒硬度与胚乳结构的关系、籽粒硬度对面粉品质和面制品品质的影响、籽粒硬度的遗传规律、品种与环境对籽粒硬度的影响、籽粒硬度育种改良等方面介绍了国内外相关领域的研究现状,并对未来发展提出展望,为小麦育种中籽粒硬度的改良提供参考。

普通小麦TaZIP29-7B基因的克隆及表达研究

金属离子在小麦生长过程中起重要作用,但土壤中金属离子含量过高,会对小麦生长造成损害。锌铁转运蛋白ZIP家族(ZRT,IRT-like protein,ZIP)广泛存在于植物中,参与多种金属离子的转运,也能提高植物的耐盐性。利用同源克隆技术获得AtZTP29在小麦中的同源基因TaZIP29-7B,并获得其启动子序列,利用生物信息学技术对所获得的基因以及启动子序列进行初步分析,预测启动子顺式作用元件,通过实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析小麦TaZIP29-7B基因在根和叶中在不同金属离子溶液处理下的表达情况,以研究该基因在小麦体内中对重金属转运的作用。结果表明:序列分析显示TaZIP29-7B基因(登录号MK203894)编码277个氨基酸,TaZIP29-7B蛋白为疏水性蛋白,定位在细胞膜上,存在信号肽,属于分泌蛋白,第89~263位置间的结构功能域ZIP,属于典型的ZIP超级家族结构域,具有8个跨膜区;进化分析显示TaZIP29-7B与单子叶植物山羊草(Aegilops tauschii)ZIP29蛋白同源性最高;启动子中存在多种响应胁迫的顺式作用元件;qRT-PCR结果显示,小麦TaZIP29-7B基因在外界重金属盐的变化下表达量有所变化。说明研究结果为进一步改良小麦抗盐性提供了参考。

普通小麦TaTFL1基因的克隆及表达特性研究

TFL1基因是植物花序分生组织特异性基因,其主要功能是维持植物营养生长和花序的无限生长。本研究利用同源克隆技术获得了TaTFL1部分同源基因的cDNA序列和启动子序列,并利用生物信息学技术对其序列组成、结构特征及进化关系进行了初步分析,并对启动子区顺式作用元件进行了预测,进一步通过实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术对该基因在中国春不同组织以及各组织不同发育阶段的表达情况进行分析。结果表明,TaTFL1蛋白为疏水性蛋白,无信号肽,定位于细胞质中;进化分析显示,TaTFL1与单子叶植物的亲缘关系较近;在启动子中存在着大量的光响应元件,以及分生组织表达相关的顺式调控元件(CAT-box)。qRT-PCR结果表明,TaTFL1基因在各组织中皆有表达,且均表现为花前表达量明显高于花后;在叶片中表达量较低,而在花前的穗下茎中表达量最高,在幼芽、颖壳和籽粒中也有微弱的表达;不同发育阶段的幼穗中,TaTFL1在1～2cm的幼穗中表达量最高,随着幼穗的发育呈现出下降的趋势,且与其他组织相比始终维持着较高的表达水平。综上所述,TaTFL1蛋白具有TFL1家族的典型结构,在小麦幼穗发育初期发挥重要作用。

小麦品种陕253γ-醇溶蛋白基因的克隆、原核表达与功能鉴定

利用设计合成的特异γ-醇溶蛋白基因引物,采用PCR方法从小麦品种陕253克隆获得一个γ-醇溶蛋白基因(GenBank登录号为GQ857626)。序列分析表明,该基因编码产物的II区由于碱基转换产生一个额外的半胱氨酸残基。构建了GQ857626的原核表达载体并转入表达菌株E.coli Rosetta gami B(DE3),IPTG诱导其成功表达。使用HisTrap HP组氨酸标记亲和层析柱纯化该基因的表达产物,并使用4 g粉质仪分析其功能。结果显示,将此纯化蛋白通过氧化还原反应整合到基础面粉后,面团的形成时间缩短,稳定时间减少,弱化度增加,导致主要的粉质指数明显下降,说明该亚基对面团流变学性质整体表现不利。

小麦品种“陕253”PDI基因的克隆、原核表达及蛋白纯化

为进一步研究控制小麦蛋白二硫键形成的关键蛋白即蛋白质二硫键异构酶(PDI),运用RT-PCR方法克隆出小麦品种"陕253"PDI基因的cDNA序列,基因登陆号为HQ911363。序列分析表明,HQ911363全长为1 539 bp,编码512个氨基酸,含有PDI典型的异构酶活性的催化位点-CGHC-和内质网驻留信号肽-KDEL-。构建该基因的原核表达载体,在宿主菌E.coliBL21(DE3)中经IPTG诱导表达融合蛋白,并对表达蛋白进行了纯化。SDS-PAGE及Western-blot检测证实融合蛋白诱导表达并纯化成功。

普通小麦中α-醇溶蛋白基因(GQ891685)的克隆、表达及品质效应鉴定

【目的】利用E.coli体外大量高效表达带有1个额外半胱氨酸残基的α-醇溶蛋白,经Ni+-NTA柱纯化获得目标蛋白,通过氧化-还原反应将其整合到基础面粉中,利用粉质仪研究其对面团流变学特性的影响,以确定该基因表达产物的加工品质效应。【方法】根据α-醇溶蛋白基因编码区保守序列设计引物,从小麦品种陕253中克隆到1条含α-醇溶蛋白基因编码区的目的片段,长度为1243bp(GenBank登录号GQ891685),构建了该基因的原核表达载体pET32a-S253-Agli,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中经IPTG诱导表达,对表达的蛋白进行亲和层析及低温冷冻干燥回收、纯化,通过微量掺粉试验,在4g粉质仪上测定其对面团流变学特性的影响。【结果】该基因片段包含900bp的完整编码序列及部分5′-调控元件;Uniq domainⅡ区第6位氨基酸密码子C→G的转换,导致丝氨酸Ser→半胱氨酸Cys的变化,这1额外的半胱氨酸将有可能参与形成1个分子间二硫键;用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE及Western blotting检测,证实融合蛋白表达成功并主要以包涵体形式存在;粉质结果表明,添加S253-Agli蛋白虽然能够增加面团的带宽及机械耐力系数,却因显著缩短面团稳定时间及形成时间而对面团的粉质参数产生了总体的负面效应。【结论】具有1个额外半胱氨酸残基的α-醇溶蛋白GQ891685增强了面筋弹性,但降低了面筋强度。

小麦NAC转录因子的基因克隆与序列分析

为了深入研究小麦中NAC家族转录因子基因,针对NAC基因家族成员,设计了覆盖其全长编码区的1对特异引物,从陕253小麦品种中克隆了2条大小分别为1 463、1549 bp的片段,命名为TaNAC2、TaNAC4(GenBank登录号为HQ872050-HQ872051)。序列分析表明,这2个序列包含典型NAC的完整编码序列,包括两个内含子,具有完整的开放阅读框;推导的氨基酸序列分别为383、405个,这2个基因在N-端均具有NAC基因的典型DNA结合结构域,即NAC结构域,且氨基酸序列在该结构域的A、B、C、D、E5个亚区高度保守,仅在C亚区出现一个氨基酸的差异L-M,而且在C-D区出现罕见的半胱氨酸变异,此发现对于小麦品质的研究非常重要。同时发现这2个NAC类转录因子都不含有核定位信号(NLS),但是有相关的转录调控功能区域。通过系统进化树分析,证实克隆序列属于NAC基因家族成员,并且发现的TaNAC4属于NAC转录因子家族的NAM亚组,TaNAC2属于NAC转录因子家族的CUC亚组。

小麦PPO基因等位变异及面粉白度特性分析

利用分子标记PPO18和STS01对173份供试小麦品种Ppo2-A和Ppo2-D位点的等位基因变异进行分子检测,并根据品种间不同PPO等位基因组合类型将供试小麦品种进行分类,同时对多酚氧化酶PPO活性进行生化测定及面粉白度测定分析。结果表明,173份小麦品种共检测出Ppo-A1b/Ppo-D1a、Ppo-A1b/Ppo-D1b、Ppo-A1a/Ppo-D1a和Ppo-A1a/Ppo-D1b4种等位基因组合类型,且各基因组合类型出现的频率分别为38.7%、13.9%、35.8%和11.6%;供试小麦品种不同位点PPO等位基因出现的频率差异较大,2A位点等位基因Ppo-A1a、Ppo-A1b出现频率相近,而2D位点等位基因Ppo-D1a出现频率是Ppo-D1b的3倍;所测定的173份小麦品种PPO活性均值为117.3A475/(min.mg),其中低PPO品种所占比例较高;4种基因组合类型PPO活性顺序为Ppo-A1a/Ppo-D1b>Ppo-A1a/Ppo-D1a>Ppo-A1b/Ppo-D1b>Ppo-A1b/Ppo-D1a,且彼此间差异均达到显著水平(P<0.05);供试小麦的面粉白度均值为73.0%,达到国家面粉白度等级一级标准的品种38份,占供试小麦总数的22.0%;其中基因组合为Ppo-A1a/Ppo-D1b的品种面粉白度显著低于其他3种基因组合。总体来看,供试的小麦品种间面粉白度及籽粒PPO活性变异范围较广,面粉白度与PPO活性呈显著负相关,且控制PPO的主效基因的等位变异对PPO活性及面粉白度均有显著影响。对供试小麦品种的面粉白度、PPO活性表现及PPO等位基因组合类型进行综合考察,筛选出23份具有高白度低PPO活性的小麦品种,可以作为高白度低PPO活性小麦育种的亲本材料。

小麦Waxy蛋白亚基毛细管电泳分离体系的构建

为构建Waxy蛋白亚基的快速、高效、高通量毛细管电泳分离鉴定体系,为该亚基理化特性的分析、功能的发掘及含Waxy蛋白亚基种质的快速筛选提供参考依据,以小麦中国春为材料,采用逐一优化毛细管电泳体系参数的方法,系统研究了毛细管电泳中缓冲液各成分以及pH值对中国春中Waxy蛋白亚基出峰效果的影响,初步构建了普通小麦Waxy蛋白亚基的最佳分离体系。结果表明,在检测波长为214nm、以0.05mol·L-1硼砂＋8%乙腈＋0.8%SDS溶液（pH 9.5）为缓冲液、分离电压20kV、温度25℃、进样压力0.5psi×5s时,在6~9min处出现峰高约0.015au的三个主峰,且图形清晰,基线水平,重复性好。本研究构建的毛细管电泳系统分离体系可有效分离普通小麦Waxy蛋白亚基。

小麦农艺性状与品质特性的多元分析与评价

估算96个小麦品种(系)的11个农艺性状和10个品质特性参数的主成分,并以主成分和欧氏距离为基础,分别作二维排序分析和聚类分析。农艺性状的前4个主成分反映了85.3450%的原始数据信息量;品质特性的前4个主成分代表了89.1483%的原始数据信息量。以96个材料的主成分得分绘制二维排序图,27个小麦品种(系)表现为矮秆、子粒和旗叶较大,丰产性较好、综合农艺性状优良;32个小麦品种(系)表现为铁、锌含量较高,加工品质较好、综合品质特性优良。在系统聚类图中,农艺性状和品质特性分别被聚成5类。综合农艺性状较好的材料主要集中在第Ⅲ类和第Ⅳ类;综合品质特性较好的材料主要集中在第Ⅰ类和第Ⅱ类。综合分析发现,同时兼顾丰产性较好且子粒铁、锌含量较高,品质特性较好的小麦品种(系)有:泰山9818、西农822、轮选719、杨-31、西安837和中育9383。将聚类分析和二维排序分析结合起来,能较好的对小麦的性状组成做出综合评价,鉴定和评价出优质、高产、综合性状优良的小麦品种(系),为小麦遗传育种提供优良的种质资源,为合理选配亲本提供参考。

小麦TaCP3基因的克隆及其参与非生物胁迫的表达分析

半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease,CP)是植物中重要的蛋白酶家族之一,广泛参与植物的各种生理过程;TaCP3属于papain-like(木瓜蛋白酶)家族的半胱氨酸蛋白酶,在小麦的生长发育及抗逆中起到重要作用。为研究TaCP3基因的结构特征,以及在干旱、高盐、低温和高温胁迫下的表达情况,从小麦抗旱品种西农538中克隆了TaCP3基因,该基因仅含1个1125bp的开放阅读框,编码374个氨基酸,在蛋白氨基端有一个28个氨基酸残基组成的信号肽,羧基端具有木瓜蛋白酶亚家族的保守结构域。生物信息学分析表明,TaCP3与大麦和山羊草半胱氨酸蛋白酶基因相似性最高。同时,本研究构建了pcold-TF/TaCP3原核表达载体,通过转化大肠杆菌BL21(DE3),成功表达了TaCP3重组蛋白,分子量约为40kD。qRT-PCR结果表明,TaCP3的表达对干旱、高盐、低温和高温胁迫均有响应,初始都呈先降后升的趋势;且对干旱胁迫有强烈的正向响应。

小麦TaCYP78A5基因的克隆及生物信息学分析

细胞色素P450(Cytochromes P450)蛋白家族含有硫羟基和血红素结构域,参与多种生物合成,CYP78A家族成员对籽粒大小形成有重要的功能。利用同源克隆的方法,分别从小麦大粒品系‘P271’和小粒材料‘中国春’中扩增到位于2AS、2BS、2DS上的TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D基因,编码534、544、549个氨基酸。通过分析发现在‘P271’和‘中国春’克隆到的TaCYP78A5序列一致,说明TaCYP78A5基因在这2个粒型的小麦中是保守的。CYP78A家族在水稻和拟南芥中具有非自主性细胞表达模式,结合对CYP78A家族的生物进化关系研究发现,CYP78A家族的各个基因在单子叶植物中是保守的。‘P271’和‘中国春’籽粒大小的差异,可能是TaCYP78A5基因在‘P271’中的基因表达量高于‘中国春’,引起种子发育过程中内表皮细胞的增殖,从而促进种子表皮增大,使得‘P271’种子大小和质量增加。

黑麦籽粒Waxy蛋白亚基的高效分离与鉴定技术体系的构建

【目的】构建用于制备级分离及高效鉴定黑麦籽粒Waxy蛋白亚基的技术体系,为该亚基理化特性的分析、功能的发掘及Waxy种质的快速筛选等提供理论参考。【方法】设计特异引物从灌浆期间的奥地利黑麦籽粒cDNA中克隆获得Waxy,并进行体外表达;利用DuoFlow对籽粒蛋白提取物进行纯化,对峰值收集物、原核表达产物及其Ni柱纯化的重组Waxy蛋白进行SDS-PAGE分离,挖取蛋白条带进行MALDI-TOF质谱鉴定,结合经由基因序列所推导的氨基酸序列,确定回收产物的Waxy蛋白属性;在优化电泳条件的基础上构建针对Waxy蛋白的毛细管电泳体系;同时,利用部分黑麦品种对DuoFlow及CE体系的有效性进行验证。【结果】核苷酸序列分析表明,从奥地利黑麦cDNA中克隆获得一条覆盖Waxy全长的编码序列(GenBank登录号:KF559182),其理论编码产物约为60 kD;利用DuoFlow Q1阳离子交换柱,以低浓度Tris-Hcl(20 mmol·L-1Tris-Hcl,pH 9.5)进行蛋白挂柱,高浓度NaCl(20 mmol·L-1Tris+1 mol·L-1NaCl,pH 9.5)进行蛋白洗脱,214 nm波长检测,实现了对籽粒Waxy蛋白的DuoFlow高效分离;纯化产物的SDS-PAGE条带大小、质谱鉴定肽段与黑麦、小麦Waxy蛋白序列相似性的统计结果表明,DuoFlow峰值回收产物具有黑麦Waxy亚基一致的特征序列,故属于Waxy蛋白;以DuoFlow纯化产物为标准样,以0.05 mmol·L-1硼砂+15%乙腈+1%SDS溶液(pH 9.5)为缓冲液,采用分离电压20 kV,温度25℃,检测波长214 nm,压力进样,0.5 psi×5 s,在11—12 min处获得峰值约12 mAU单一主峰,图形清晰,基线水平,从而构建了Waxy蛋白的CE鉴定体系,且籽粒Waxy蛋白提取物能直接用于对该亚基的检测;同时,利用黑麦品种对上述体系的验证结果表明,DuoFlow及CE体系适于对Waxy亚基的高效分离与通量检测。【结论】从奥地利栽培黑麦cDNA文库中克隆获得Waxy完整编码序列,构建了能特异分离黑麦籽粒Waxy蛋白的DuoFlow制备级纯化体系,并确立了黑麦籽粒Waxy亚基的毛细管快速鉴定体系。

西农538 LMW-GS基因的克隆、原核表达及功能鉴定

为了探索普通小麦品种西农538的LMW-GS对面粉加工品质的影响,根据NCBI中已公布的LMW-GS基因序列,设计了一对特异性引物,从西农538基因组DNA中克隆出LMW-GS基因后,对其进行原核表达及掺粉试验。序列分析表明,克隆得到的LMW-GS基因序列(GenBank登录号为KX452081)有单一完整的开放阅读框,编码区长915bp,无内含子。同源性比对及进化树分析发现,该基因属于Glu-D3、Type V(Group 10)、m型、C组LMW-GS基因。SDS-PAGE和Western blot分析表明,该基因原核表达成功。微量掺粉试验表明,诱导表达的蛋白对小麦面粉加工品质有负效应。

簇毛麦新型低分子量谷蛋白亚基的分子克隆与序列分析

为发掘低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)新的变异类型,通过设计引物和特异PCR扩增,从簇毛麦TA2127基因组DNA中得到14个LMW-GS基因,GenBank登录号分别为HQ615147～HQ615160。序列分析表明,所有基因具有完整编码区,长度为831bp和846bp,可编码277和282个氨基酸残基,推导的氨基酸序列分析显示,14个基因编码的蛋白序列都缺少一段N-端保守区,且N-端序列是一种新的类型;在14个LMW-GS基因中检测到19个SNPs和1个16bp的缺失。系统进化分析表明,簇毛麦LMW-GS与ω-醇溶蛋白和HMW-GS亲缘关系相对较远,与普通小麦Glu3-的低分子谷蛋白基因进化关系相对较近。