细胞因子对人类胚胎干细胞分离克隆的影响

目的 观察白血病抑制因子、干细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子对人类胚胎干细胞分离克隆的影响。方法 在基础细胞培养液中加入不同的细胞因子组合 ,培养后观察人类胚胎干细胞集落形成数和各组的最高传代数。结果 细胞因子添加与否对人类胚胎干细胞原代培养无显著的影响 ,而对后继培养有显著影响。结论 在人类胚胎干细胞初代培养时可以不添加细胞因子 ,细胞的克隆过程中添加细胞因子有利于细胞的生长。

EGF和GSH对牛卵母细胞体外受精的影响

研究了牛卵泡卵母细胞体外受精时向成熟液中加入EGF(表皮生长因子),受精液中加入GSH(谷胱甘肽)对受精率和囊胚率的影响。成熟液以M-199为基础液并加入一定浓度的促性腺激素和OCS,作为成熟液的对照组,试验组加入不同浓度的EGF。受精液以改良TALP为基础液并加入一定浓度的BSA、肝素和咖啡因,作为受精液的对照组,试验组加入不同浓度的GSH。早期胚胎培养液为SOFaa。在成熟液中加入10ng/mlEGF和50ng/mlEGF组时,试验组与对照组的受精率分别为76.00%(114/150)、76.71%(112/146)和60.70%(85/140);囊胚率分别为23.68%(27/114)、24.11%(27/112)和17.64%(15/85);在受精液中加入1mMGSH和10mMGSH组时,试验组与对照组的受精率分别为71.66%(86/120)、63.28%(81/128)和76.00%(114/150);囊胚率分别为34.88%(30/86)、24.69%(20/81)和23.68%(27/114)。结果表明,成熟液中加入EGF对牛卵母细胞的体外成熟和受精后的早期胚胎的发育都有促进作用,在一定范围内增加EGF浓度,不会提高受精率和囊胚率;受精液中加入一定浓度GSH能够提高受精率和囊胚率,但是在高浓度的GSH时则影响受精率。

小鼠Nanog基因的克隆及对人宫颈癌上皮细胞的作用

目的:克隆小鼠Nanog基因并构建带绿色荧光蛋白的真核表达载体pG-Nanog,观察其对人宫颈癌上皮细胞(Hela细胞)中的表达,旨在为进一步观察其对成体细胞的表型变化及细胞增殖奠定前期实验学基础。方法:实验于2006-03/09在西北农林科技大学陕西省干细胞研究中心完成。Nanog基因的克隆参照庄淑珍的方法。Nanog基因真核表达载体的构建参照GeneBank中的小鼠Nanog基因序列,以pNA992为模板扩增Nanog基因,PCR产物以BglⅡ和SacⅡ双酶切,同时将pEGFP-C1用BglⅡ和SacⅡ鉴定,将该质粒命名为pG-Nanog。Hela细胞用含10%新生牛血清的Dulbecco’s改良培养基(Dulbecco’sModifiedEagleMedium,DMEM)培养,转染Hela细胞。转染前1d,在6孔板的每个孔中接种1.2×105个细胞,待细胞生长至60%～70%汇合时,取pG-Nanog与空载体各4μg分别加入500μL无血清无抗生素的DMEM培养液中,同时将6μL稀释于500μL无血清无抗生素的DMEM(干粉)培养液中,将两者混合,室温静置20min,将复合物加入到细胞中,置37℃,体积分数0.05的CO2培养箱中转染24h后吸出复合物加入完全培养基,48h后观察荧光。合成内源对照β-actin,收集转染4d后的细胞提取RNA,反转录为cDNA,然后分别扩增Nanog基因和β-actin基因。采用RT-PCR的方法检测Hela细胞中Nanog基因的表达。结果:①pEGFP-C1载体经双酶切后获得约1kbp的Nanog基因真核表达载体片段,同预期结果相一致,测序结果同GeneBank中的序列同源性达到99.7%。②将转染48h后的Hela细胞置于荧光显微镜下观察,可见明显的荧光,转染pG-Nanog的细胞绿色荧光蛋白集中于细胞核,将转染4d后Hela细胞的总RNA进行RT-PCR检测,产物经琼脂糖电泳分析,只有转染pG-Nanog的细胞中才能够检测到Nanog基因的相应条带。③转染48h后,对细胞进行抗增殖细胞核抗原免疫组化染色,未转染细胞和转染空质粒细胞及转染pG-Nanog细胞染色结果均呈阳性,转染了pG-Nanog的Hela细胞与正常细胞和转染空载体的细胞相比细胞形态发生了一定的改变,细胞表面形成了许多突起。结论:小鼠Nanog基因的克隆、真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达均获得成功,并观察到Hela细胞发生了形态的改变。

小鼠心肌细胞的体外培养

对采用组织块法和酶消化法体外培养小鼠心肌细胞的结果进行了比较,并对体外培养心肌细胞的生理活性进行了初步测定。结果表明,用组织块法分离培养胎、乳鼠心肌可得到自主节律性搏动的心肌细胞;分别用1g/L胶原酶+10g/LBSA,0.5g/L胰酶+1g/L胶原酶,1g/L胰酶分离培养胎、乳鼠心肌,均可得到大量心肌细胞,且细胞活力较好,能自主博动20d以上;用上述2种方法分离培养成年鼠心肌,结果均不理想;在载有自主节律性搏动的小鼠心肌功能性细胞团的培养皿中加入Ca2+和肾上腺素后,细胞团搏动速度加快,搏动力加强;加入K+后则细胞团搏动速度减缓,搏动力减弱,其对钾、钙、肾上腺素的反应与在体内基本一致,表明体外培养的小鼠心肌细胞具有与在体心肌细胞相似的功能。

发情牛血清和绵羊卵泡液对绵羊卵母细胞体外成熟和受精的影响

本试验研究了绵羊卵泡卵母细胞在体外成熟时,以M-199为基础液,加入FBS,OCS,以及不同直径(小于8mm或大于10mm)卵泡的卵泡液对体外成熟率和体外受精率的影响。在添加同等浓度促性腺激素(FSH,0.4μg/ml;LH,2iu/ml)时,添加5%FBS或5%OCS的成熟率分别为10.00%和69.30%(P<0.05);体外受精分裂率分别为0和60.84%(P<0.05)。在添加以上浓度促性腺激素和5%OCS的基础上添加3%大卵泡液或小卵泡液时,卵母细胞成熟率分别为53.10%和78.20%(P<0.05);体外受精分裂率分别为50.00%和71.67%(P<0.05)。结果表明,发情牛血清配合大卵泡液可以充分满足绵羊卵母细胞体外成熟的需要。

IVF—ET中授精方式及移植胚胎质量对妊娠结局的影响

目的探讨体外受精-胚胎移植中不同授精方式及移植胚胎情况对妊娠结局的影响。方法对2007年6～12月完成的116个体外受精-胚胎移植周期的病例，分别根据授精方式和移植胚胎数进行分组，统计学分析比较各组妊娠情况。结果①按授精方式分为常规体外受精-胚胎移植组、胞浆内单精子注射组和体外受精／胞浆内单精子注射组。与常规体外受精组66．23％的受精率比较，体外受精／胞浆内单精子注射组体外受精的受精率明显降低（X2=29．096，P〈0．01），仅为42．66％；3组继续妊娠率依次为29．69％、40．63％、20．00％，各组间比较无显著性差异（P〉0．05）；②按移植胚胎情况分组：无优质胚胎组及分别有1个、2个和3个优质胚胎组的继续妊娠率依次为10．00％、36．84％、34．78％和37．50％，无优质胚胎组较有优质胚胎各组继续妊娠率降低，但无统计学意义（X2分别为3．955、1．000、2．946，均P〉0．05），优质胚胎各组间比较亦无显著性差异（P〉0．05）；各组多胎发生率依次为0、14．29％、50．00％和33．33％，有1个优质胚胎组的多胎发生率低于其他优质胚胎组，但无统计学意义（X2分别为2．839、1．000、1．000，均P〉0．05）。结论授精方式及移植胚胎质量与妊娠结局有相关性，单优质胚胎移植可能会明显减少多胎发生率。