慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒cccDNA和血清病毒学标志物相关性的研究

目的探讨CHB患者血清病毒学标志物及肝组织、血清HBV DNA与肝组织HBVcccDNA的关系。方法应用实时荧光定量法进行20例CHB患者肝组织HBVcccDNA、肝组织及血清HBV DNA定量的测定,时间分辨荧光免疫分析法进行HBsAg、HBeAg、HBcAb等血清学标志物的测定,分析肝组织HBVcccDNA与肝组织HBV DNA、血清HBV DNA、HBsAg及HBeAg定量水平之间的关系。相关性分析采用Spearman相关性检验。结果所有患者肝组织中均能检测到HBVcccDNA,含量在7.63×10~4拷贝数/mg^9.46×10~8拷贝数/mg(对数值:7.55±1.08)之间;肝组织HBVcccDNA与肝组织HBV DNA呈显著正相关关系(r=0.859,P<0.01),与血清HBV DNA呈显著正相关关系(r=0.640,P<0.01);肝组织HBVcccDNA与HBeAg呈显著正相关(r=0.676,P<0.01),与血清HBsAg无相关性(r=0.195,P>0.05),与HBcAb呈显著负相关(r=-0.624,P<0.01)。结论 CHB患者肝组织内HBVcccDNA呈稳定的中等水平复制;血清HBsAg定量尚不能作为反映肝组织中HBVcccDNA水平的指标,结合肝组织HBV DNA、血清HBV DNA等定量检测可以更全面反映HBV复制水平及患者病情评估。

慢性HBV携带者YMDD自然变异的追踪研究

目的探讨慢性HBV携带者YMDD自然变异随时间的推移发生变化的情况。方法随机选择未经抗病毒治疗的慢性HBV携带者103例,分别在开始、1年、2年时观察血清HBV DNA、HBV血清学标志物、肝功能、YMDD变异的变化情况。结果在开始检测的103例慢性HBV携带者中,YMDD阳性27例,观察2年后4例转为非活动性HBsAg携带者且YMDD转为阴性;76例YVDD变异阴性的患者中,观察2年后1例病毒水平增高并出现YMDD变异。结论 YMDD自然变异株在慢性HBV携带者中相对较稳定,YMDD自然变异株可随野生株的消失而消失。

慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA定量检测方法的建立

目的建立一种灵敏、特异地检测肝组织中HBV cccDNA的实时荧光定量PCR方法。方法利用HBV cccDNA与rcDNA结构上的差异,设计检测HBV cccDNA的特异性引物及探针,以含HBV基因组全序列的P1.2Ⅱ质粒为检测HBV cccDNA的标准品,建立标准曲线。肝组织标本中提取的DNA分为2等份,1份经质粒安全ATP依赖的DNA酶(PSAD)酶切,作为检测HBV cccDNA的模板,另1份不酶切作为检测肝组织HBV DNA和β-actin的模板,分别进行肝组织HBV DNA和β-actin的定量测定,并以β-actin为参比,对每个细胞的HBV cccDNA和HBV DNA含量进行标准化。结果肝组织HBV tDNA的线性范围为7.41×10~6~2.66×1011拷贝数/mg(对数值:9.33±1.27),HBV cccDNA的线性范围为7.63×10~4~9.46×10~8拷贝数/mg(对数值:7.55±1.08)。HBV cccDNA含量:13.066±7.387拷贝数/cell,HBV tDNA含量:1 363.9±153.94拷贝数/cell;同一患者肝组织cccDNA含量与HBV tDNA含量比值为0.96%;肝组织HBV cccDNA与肝组织HBV tDNA呈显著正相关关系(r=0.859,P<0.01)。结论该实时荧光定量PCR法可以灵敏、特异地检测慢性乙型肝炎患者肝组织中的HBV cccDNA载量。

肝组织中β-actin定量检测方法的建立

目的构建检测肝组织中内参基因β-actin的标准品。方法以成人外周血细胞的总RNA为模板、反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人β-actin基因相应的cDNA目的片段,以pMD18-T为载体,构建形成重组质粒,电泳、鉴定测序后,用荧光定量PCR制作标准曲线。结果外周血提取的总RNA完整性良好,构建的β-actin质粒经PCR扩增后得到1条285 bp的清晰条带,测序结果与目的片段完全一致,且质粒的原始浓度为5.0×10^(13)拷贝数/mL,倍比稀释至1.0×10~2拷贝数/mL均能得到良好的标准曲线(R^2=0.999)。结论构建β-actin基因荧光定量PCR标准质粒成功。

恩替卡韦治疗HBV DNA阴性乙型肝炎肝硬化患者临床研究

在临床中经常会遇到反复（≥3次）检测 HBV DNA 阴性，但临床提示肝硬化患者，经复方鳖甲软肝片治疗6个月无效。本研究对该类患者进行观察。 资料和方法 一、临床资料：本研究中60例患者为本院2008年6月至2013年4月住院或门诊患者，入选符合以下条件：①慢性乙型肝炎病史至少6个月，A／G≤1；②PLT 60～80×109／L；③B超示肝脏回声呈粗大不均光点，门静脉直径≥1．4 cm，脾静脉直径≥0．9 cm，脾厚≥4 cm；④肝纤维化四项指标：HA，PCIII，LN，Ⅳ-C，其中至少2项或2项以上异常者；⑤HBV-M：HBsAg，HBcAb 阳性或HBsAg，HBeAg，HBcAb 阳性或 HBsAg，HBeAb，HBcAb 阳性，但 HBV DNA＜1000拷贝／mL；⑥经用复方鳖甲软肝片6个月无效［1］者。治疗组30例，年龄35～70岁，男24例，女6例，对照组30例，年龄30～66岁，男25例，女5例，两组临床资料均具有可比性。