杀虫植物杠柳研究进展

萝藦科植物杠柳Periploca sepium是中国分布广泛的一种传统杀虫植物,因其次生代谢产物具有显著的杀虫活性,被认为是一种潜在的植物源杀虫剂。本文综述了杠柳的杀虫抑菌活性、主要杀虫活性成分、作用机理以及制剂开发与应用,并结合笔者的工作,重点介绍了杠柳主要杀虫化合物杠柳新苷P在东方黏虫Mythimna separata幼虫中肠细胞膜上的作用靶标及其靶标验证方面的研究进展。最后,展望了杠柳作为商业化杀虫剂研究的未来发展趋势,以期为中国绿色农药创制提供参考。

地果地上部分抑菌活性研究

采用孢子萌发法和菌丝生长法测定地果地上组织甲醇提取物对黄瓜霜霉病菌和马铃薯晚疫病菌的抑菌活性,提取物对2种供试病菌的孢子囊萌发,对马铃薯晚疫病菌菌丝生长均具有强烈的抑制作用,浓度为1000μg/mL时,抑制率均达到90%。盆栽试验和田间药效试验结果表明,10%的地果提取液稀释100倍对黄瓜霜霉病菌和马铃薯晚疫病菌的盆栽防效分别为85.89%和93.82%,对黄瓜霜霉病的防效为76.76%。

天葵子化学成分及抑菌活性研究

为探究天葵子化学成分及其抑菌活性。采用色谱法从天葵子中分离得到13个化合物,利用波谱学等方法鉴定了它们的化学结构,分别鉴定为蝙蝠葛内酯(1)、格列风内酯(2)、β-谷甾醇(3)、胡萝卜苷(4)、对羟基苯乙醇(5)、邻苯二甲酸-二-2-乙基-己酯(6)、小檗碱(7)、木兰碱(8)、唐松草酚定(9)、果糖(10)、紫草氰苷(11)、小檗红碱(12)、bauhinin(13)。其中化合物12和13为首次从天葵子中分离得到。采用滤纸片琼脂扩散法测定了所得化合物的抑菌活性,其中化合物7和12具有明显的抑菌活性,在载药量为5μg/片时,化合物7对白菜软腐病菌和猕猴桃溃疡病菌的抑菌圈直径分别为19.4、13.3mm;化合物12对青枯病菌和猕猴桃溃疡病菌的抑菌圈直径分别为13.2、12.8mm,表明天葵子对于防治作物细菌性病害具有较好的应用前景。

臭椿酮对植物种子萌发及相关生理生化指标的影响

臭椿酮是一种分布于臭椿中的苦木苦味素类化合物,具有广谱的除草活性。本研究测定了臭椿酮对多种植物种子萌发的抑制作用,及对活性氧(ROS)释放、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及过氧化物酶(POD)等相关生理生化指标及植物细胞有丝分裂的影响,以期为进一步研究臭椿酮的除草作用机制提供参考。结果表明:臭椿酮对油菜Brassica napus、稗草Echinochloa crusgalli、苘麻Abutilon theophrasti、狗尾草Setaria viridis和马唐Digitaria sanguinalis种子萌发具有较强的抑制作用,其IC_(50)值分别为3.74、9.86、9.71、3.87和3.76μg/mL;臭椿酮对种子吸水能力无明显影响;在1.00μg/mL质量浓度下,臭椿酮对植物根尖分裂有较强的抑制作用,有丝分裂指数为0.48%(清水对照组为5.85%),并可引起细胞分裂畸形;SOD、CAT与POD酶活性测定结果表明,臭椿酮可以提高植物的抗氧化能力;活性氧染色结果证明,0.10μg/mL的臭椿酮就可以诱导活性氧的爆发;细胞死亡率测定结果表明,臭椿酮的存在可导致一定比例的细胞失去活性。本研究表明,臭椿酮可通过多种方式抑制植物种子生长,既能有效抑制植物细胞分裂,又可诱导植物体内活性氧的积累。

果蝇钠通道DmNav22在双氧木脂素A作用机理研究中的应用

建立以爪蟾卵母细胞为载体的果蝇钠通道表达系统,研究双氧木脂素A的杀虫分子机理。将果蝇钠通道DmNav22与TipE亚基基因分别进行体外转录,获得DmNav22与TipE亚基基因的cRNA,将DmNav22与TipE的cRNA等质量混合,显微注射至新鲜的非洲爪蟾卵母细胞,在ND96溶液、18℃培养12~18h后采用双电极电压钳技术记录其电流,测定双氧木脂素A对钠电流的影响。结果表明,注射cRNA的非洲爪蟾卵母细胞,可记录到明显的果蝇钠通道电压门控内向电流,未注射的对照组细胞则未记录到钠电流;双氧木脂素A使钠通道失活电压依赖性向超极化方向移动。说明,果蝇钠通道在非洲爪蟾卵母细胞中成功表达,为进一步研究双氧木脂素A的作用机理奠定基础。

河朔荛花根中抑菌活性成分研究

在活性追踪指导下,采用多种分离技术从河朔荛花根甲醇提取物中分离得到12个化合物,经核磁共振波谱、质谱等技术并结合相关文献确定其结构分别为1-己酸-2,3-硬脂酸甘油三酯(1)、β-谷甾醇(2)、月桂醇(3)、顺-十八碳-9-烯酸(4)、(2E)-庚基-3-(3, 4-二羟基苯基)丙烯酸酯(5)、(–)-pluviatolide(6)、1β-hydroxy-10β-H-guaia-4,11-dien-3-one(7)、异狼毒素(8)、新狼毒素B(9)、瑞香酚(10)、单棕榈酸甘油酯(11)和(+)-去甲络石甙元(12)。其中,化合物3、4和6～12均为首次从河朔荛花中分离得到。抑菌活性测定结果表明:异狼毒素(8)和新狼毒素B(9)对马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans菌丝生长和孢子萌发均表现出明显的抑制作用,其中对菌丝生长的EC50值分别为68.4μg/mL和44.9μg/mL,对孢子萌发的EC50值分别为25.1μg/mL和14.0μg/mL。

我国水稻稻瘟病菌对三环唑抗性研究现状

三环唑是我国大面积防治水稻稻瘟病的主要药剂。近年来,随着三环唑田间防效降低报道的增多,三环唑的抗性发生发展情况倍受关注。本文全面阐述了三环唑在我国的登记情况以及抗性研究现状。

新烟碱类杀虫剂吡虫啉的抗性研究进展

吡虫啉因其选择性高、杀虫谱广近年来已经成为全球发展最为迅速的农药之一。在我国推广使用20余年,吡虫啉的抗性风险已经越来越受到重视。本文论述了吡虫啉在多种作物上的抗性发展情况,为延缓吡虫啉的使用寿命以及其抗性监测及抗性治理提供一定参考。

除草剂NWAFU-J10创制经纬

以除草剂苯噻酰草胺、草除灵、苯噻隆和噻唑禾草灵中共有的苯并噻唑为起始原料,基于非活性基团多样化衍生策略,通过苯并噻唑3-位引入取代苯基和吡啶基构建化合物库。采用小杯法评价了所合成化合物对稗草和马齿苋的除草活性,发现先导化合物3-(3-氯-5-三氟甲基吡啶-2-基)苯并噻唑2-酮(化合物99)。再先导优化,最终获得具有3-吡啶基苯并噻唑-2-酮新颖分子骨架的高除草活性候选化合物NWAFU-J10。NWAFU-J10合成工艺简便、生产成本较低,对大多阔叶杂草表现出极高除草活性,具有良好产业化开发前景。

白纹伊蚊nAChR-α5基因RNA干扰体系的构建及其在双氧木脂素A抗性中的作用

【目的】探究白纹伊蚊Aedes albopictus烟碱型乙酰胆碱受体α5(nicotinic acetylcholine receptorα5,nAChR-α5)亚基是否是双氧木脂素A(haedoxan A,HA)潜在的作用靶标,为白纹伊蚊的有效防治提供参考。【方法】利用PCR克隆白纹伊蚊nAChR-α5编码区(coding sequence,CDS)序列并构建系统发育树;利用RT-qPCR检测白纹伊蚊nAChR-α5在不同发育阶段(1-4龄幼虫、蛹和未吸血的雌成蚊)的表达量;利用壳聚糖/dsRNA纳米颗粒介导RNAi技术敲减白纹伊蚊2龄幼虫nAChR-α5的表达量;生物测定RNAi后的白纹伊蚊3龄幼虫对HA[LC 30(0.3 mg/L)和LC 50(0.4 mg/L)]的敏感性。【结果】白纹伊蚊nAChR-α5的CDS长1296 bp,编码431个氨基酸,具有nAChR的典型半胱氨酸环(Cys-loop)。蛋白序列比对和系统发育树表明白纹伊蚊nAChR-α5与埃及伊蚊A.aegypti的nAChR-α5同源性最高,亲缘关系最近。nAChR-α5在白纹伊蚊4龄幼虫中的表达量最高,其次是在雌成虫中的;饲喂壳聚糖/ds nAChR-α5纳米颗粒(dsRNA浓度为0.3%w/w)后24 h时对白纹伊蚊2龄幼虫nAChR-α5的干扰效率最高,达到70%。生测结果表明,与饲喂不含dsRNA饲料的空白对照和饲喂含有壳聚糖/ds GFP纳米颗粒饲料的阴性对照相比,在LC 30和LC 50的HA处理下,敲减nAChR-α5组的白纹伊蚊3龄幼虫死亡率显著下降9.89%~15.45%,表明敲减nAChR-α5使白纹伊蚊对HA的敏感性显著降低。【结论】白纹伊蚊nAChR-α5可能是HA潜在的作用靶标之一,HA可能通过干扰白纹伊蚊nAChR-α5的功能进而影响神经兴奋传导。

DSC1在果蝇幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路中的作用

【目的】探究果蝇钠通道1(Drosophila sodium channel 1,DSC1)在果蝇幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路(sensory-central nervous system-motor circuits,S-CNS-MC)中的作用,为果蝇的有效防治提供参考。【方法】以果蝇幼虫的S-CNS-MC为模型,以神经遗传背景不同的4种果蝇品系w^(1118)、para^(ts1)、DSC1^(-/-)和para^(ts1);DSC1^(-/-)幼虫为材料,分别在正常状态和饥饿状态下采用番茄切面觅食活动对其进行行为学研究,通过测定不同品系果蝇幼虫的兴奋性接点电位对其进行电生理学研究。【结果】番茄切面觅食活动行为学观察结果表明,正常状态下在每个观察的时间点,4种果蝇品系在番茄切面果皮中的幼虫数量均无显著差异;但饥饿状态下,随着观察时间的延长,DSC1^(-/-)品系的3龄幼虫停留在番茄中果皮部分的数量显著多于其他品系,表明在饥饿状态下敲除DSC1的果蝇幼虫反应迟钝,觅食行为减缓。电生理试验结果表明,w^(1118)和para^(ts1)品系果蝇幼虫在饥饿状态下神经回路的兴奋性接点电位(EJP)频率与正常状态下差异不显著,但DSC1^(-/-)和para^(ts1);DSC1^(-/-)品系果蝇幼虫在饥饿状态下神经回路的EJP频率均较正常状态显著下降,表明敲除DSC1的DSC1^(-/-)和para^(ts1);DSC1^(-/-)2种品系果蝇幼虫S-CNS-MC的兴奋性在饥饿状态下明显降低,这与上述觅食活动行为学结果一致。【结论】DSC1有助于果蝇幼虫在饥饿逆境条件下维持神经系统的兴奋性传导和神经回路的稳定性。

甜菜夜蛾SeGluCl剪接变异体的敲除及其对杀虫剂敏感性的影响

【目的】本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,探索甜菜夜蛾Spodoptera exigua谷氨酸门控氯离子通道(glutamate-gated chloride channels,GluCls)基因不同转录变异体编码的SeGluCls对杀虫剂敏感性是否存在差异。【方法】采用RT-PCR和RACE技术获得甜菜夜蛾SeGluCl的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除SeGluCl两个剪接变异体SeGluCl 3a和SeGluCl 3b,并构建甜菜夜蛾敲除品系(3a-KO和3b-KO),生物测定甜菜夜蛾敏感品系WH-S(对照品系)及3a-KO和3b-KO品系的3龄幼虫对阿维菌素、甲维盐和氟虫腈3种杀虫剂敏感性的差异。【结果】获得了甜菜夜蛾SeGluCl全长cDNA序列,并发现其2种剪接变异体(SeGluCl 3a和SeGluCl 3b),SeGluCl 3a(GenBank登录号:OM304353)的开放阅读框(open reading frame,ORF)长1362 bp,编码454个氨基酸,SeGluCl 3b(GenBank登录号:OM304354)的ORF长1365 bp,编码455个氨基酸。两种剪接变异体SeGluCl 3a和SeGluCl 3b编码的SeGluCls都包含4个跨膜区和1个半胱氨酸环。系统发育分析表明,SeGluCl与斜纹夜蛾S.litura和草地贪夜蛾S.frugiperda的GluCl亲缘关系最近。与对照品系WH-S相比,3a-KO和3b-KO敲除品系对阿维菌素、甲维盐和氟虫腈的敏感性无显著差异。【结论】甜菜夜蛾SeGluCl剪接变异体SeGluCl 3a和SeGluCl 3b编码的SeGluCls对阿维菌素、甲维盐和氟虫腈这3种杀虫剂的敏感性无差异。

东方粘虫中肠V-ATP酶a亚基的克隆及原核表达

对东方粘虫[Mythimna separata(Walker)]中肠V-ATPase a亚基(MS-VATPa)cDNA全长序列进行克隆、原核表达及纯化研究。采用RT-PCR和RACE技术克隆MS-VATPa基因,再亚克隆于原核表达载体pET-22b(+)以构建重组载体pET22b-MS-VATPa,将鉴定正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化目标蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot验证。结果表明:成功克隆东方粘虫中肠MS-VATPa基因的cDNA全长序列,并实现MS-VATPa基因在大肠杆菌原核表达系统中的可溶性表达。

Cylindrocarpon olidum W1菌株代谢物中壳二孢氯素及其类似物的分离及抑菌活性

采用硅胶柱层析及高效液相色谱等技术从冬青卫矛内生真菌Cylindrocarpon olidum W1次生代谢物中分离鉴定出8个抑菌活性化合物W1-1~W1-8。经核磁共振氢谱和碳谱、高分辨质谱等技术,并结合相关文献确认其为壳二孢氯素及其类似物,分别为Ilicicolin A(W1-1)、5-Chlorocolletorin B(W1-2)、Ilicicolin B(W1-3)、Deacetylchloronectrin(W1-4)、Ilicicolin C(W1-5)、壳二孢氯素(W1-6)、Cylindrol A_4(W1-7)和Cylindrol B(W1-8)。抑菌活性测定结果表明:壳二孢氯素及其类似物对烟草青枯病菌有较强的抑制作用,上述化合物的最小抑制浓度分别为6.2 5、3.1 3、>1 0 0、3.1 3、6.2 5、1 2.5、2 5和2 5μg/m L;化合物W 1-2、W1-4和W1-5对番茄灰霉病菌和油菜菌核病菌菌丝生长亦有较强的抑制作用,其中对番茄灰霉病菌的抑制中浓度(IC_(50))分别为36.45、21.60和26.69μg/m L,对油菜菌核病菌的抑制中浓度分别为20.21、16.79和12.11μg/m L。

扁茎黄芪植株中化学成分的分离鉴定及其抑菌活性

为综合开发利用药用植物扁茎黄芪Astragalus complanatus,对其非药用部位的化学成分及抑菌活性进行了初步研究。采用硅胶柱层析和LH-20凝胶层析技术从扁茎黄芪植株中分离鉴定了7个化合物,并测定了各化合物对8种细菌的抑菌活性。根据波谱分析结果,7个化合物分别被鉴定为β-谷甾醇(1)、β-sitostenone (2)、lawsaritol A (3)、3β-羟基-5α,8α-桥二氧麦角甾-6,22-二烯(4)、3′,7-二羟基-2′,4′-二甲氧基异黄烷(5)、D-1-O-甲基肌醇(6)和沙苑子苷(7),所有化合物均为首次从扁茎黄芪植株中分离得到。抑菌活性测定结果表明:化合物5对蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus、大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、白菜软腐病菌Erwinia carotovora、猕猴桃溃疡病菌Pseudomonas syringaepv.actinidiae和烟草青枯病菌Ralstonia solanacearum均有不同程度的抑制作用,其中对猕猴桃溃疡病菌、烟草青枯病菌和白菜软腐病菌的最低抑制浓度(MIC)分别为37.5、18.8和75.0μg/mL。3′,7-二羟基-2′,4′-二甲氧基异黄烷(5)的农用抑菌活性为首次报道。

辣椒碱类似物的合成及杀虫活性

基于辣椒碱结构,以取代苄胺为原料,经N-酰化反应合成了6个系列204个辣椒碱类似物,其中8个为新化合物。通过核磁共振氢谱(1H NMR)对化合物的结构进行了确证。采用叶碟法测定了目标化合物的杀虫活性。结果表明:大部分化合物在10μg/片下对供试的3龄东方黏虫Mythimna separata有较强的毒杀活性,其中化合物A30、D20、D30、D35、E30和F3048 h的致死率达100%,化合物D19、D21、D22、D23、D31和E3148 h的致死率在90%以上。初步构效关系表明,苄胺苯环上氟原子单取代衍生物的杀虫活性优于氟原子双取代衍生物,其中以2-氟苄胺衍生物(D系列)杀虫活性较好;此外,酰基为2-噻吩甲酰时的杀虫活性明显优于其他取代基,表明酰基对该类化合物的杀虫活性也有显著影响。

杀虫活性化合物杠柳新苷P对东方粘虫中肠细胞上结合蛋白的影响

杠柳新苷P是从杠柳根皮提取物中分离得到的一种甾体糖苷类化合物,对东方粘虫表现出较好的杀虫活性。为了进一步研究其杀虫机理,探究杠柳新苷P作用于东方粘虫中肠疑似作用位点,通过对杠柳新苷P进行结构修饰,与东方粘虫幼虫中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)组织体外孵育,利用其结构修饰后增强的紫外吸收特性,经蛋白分离、纯化,进而得到杠柳新苷P作用于粘虫中肠BBMV上的结合蛋白。结果表明:在粘虫中肠BBMV上存在杠柳新苷P的疑似结合蛋白,且经分离鉴定得到5种疑似结合蛋白,分别为类异翅盘蛋白、氨肽酶、二硫键异构酶、苯基贮存蛋白以及精氨酸激酶;通过进一步的分析推测,氨肽酶可能是杠柳新苷P作用于东方粘虫幼虫中肠BBMV上的结合蛋白。初步明确杠柳新苷P作用于东方粘虫中肠的疑似作用位点,但仍需进一步的验证工作进行确认,为今后研究杠柳新苷类化合物的作用机理及靶标提供依据。

杠柳新苷P和E对粘虫和小地老虎中肠3种解毒酶的影响

为进一步探讨杠柳新苷类化合物在昆虫体内的代谢机制。比较研究高活性杠柳新苷P(Periploca sepium P,PSP)和无杀虫活性的杠柳新苷E(Periploca sepium E,PSE)对6龄粘虫幼虫(Mythimna separata)与小地老虎幼虫(Agrotis ypsilon)中肠3种代谢酶[羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、细胞色素P450-O-脱甲基酶]活性的影响。结果表明:药后8h,PSP和PSE使粘虫幼虫GST活性增加,但PSP上升趋势比PSE更高。而2种化合物对试虫CarE活性均无明显影响。药后12h,PSP和PSE使粘虫中肠细胞色素P450-O-脱甲基酶酶比活力显著下降,而小地老虎中该酶活性无明显变化。因此,可推测GST可能参与昆虫对杠柳毒素的解毒作用,而细胞色素P450-O-脱甲基酶活性被杠柳毒素抑制可能是造成粘虫中毒的机制之一。

杠柳新苷P在水和土壤中的降解与移动特性

采用室内模拟试验,研究植物杀虫活性成分杠柳新苷P在不同水体和不同类型土壤中的降解与移动特性,分析其对不同水体与不同类型土壤的污染风险性。结果表明:温度和pH对杠柳新苷P在水中的降解均有一定程度的影响。温度为50℃、pH=9时,降解速率最快,其水解半衰期为2.36d。土壤降解与土壤淋溶试验表明,杠柳新苷P在麦田土、果园土和菜园土中的降解半衰期分别为4.33、4.25和3.85d,降解速率依次为菜园土>果园土>麦田土;对比试验研究表明,在未灭菌的土壤中,杠柳新苷P的降解速率比灭菌的土壤中显著加快。

三氟羧草醚类似物的合成及除草活性

以2,5-二羟基苯甲酸甲酯和三氟羧草醚为起始原料,设计合成了3个系列20个新的三氟羧草醚类似物,通过核磁共振氢谱、碳谱对其结构进行了表征。分别采用小杯法和室内盆栽法测定了目标化合物的除草活性。结果表明,化合物III-02[5-(2-氯-4-三氟甲基苯氧基)-2-硝基苯甲酸-(6-甲基苯并噻唑-2-基)酯]对单子叶杂草的除草活性明显高于对照药剂三氟羧草醚,其对稗草Echinochloa crusgalli和马唐Digitaria sanguinalis根茎生长的EC_(50)值分别为2.03、0.93μg/mL和1.49、0.52μg/mL;在有效成分100 g/hm^(2)的施药剂量下,化合物III-02对单子叶杂草稗草、马唐及狗尾草Setaria viridis的防治效果均在85%以上,明显高于三氟羧草醚,对阔叶杂草马齿苋Portulaca oleracea、反枝苋Amaranthus retroflexus及苘麻Abutilon theophrasti的防治效果可达100%。初步构效关系表明,2-硝基苯甲酰衍生物的除草活性明显优于其2-甲氧基衍生物,三氟羧草醚苯甲酸酯衍生物对单子叶杂草的除草活性明显高于其苯甲酰胺衍生物。