杀虫植物杠柳研究进展

萝藦科植物杠柳Periploca sepium是中国分布广泛的一种传统杀虫植物,因其次生代谢产物具有显著的杀虫活性,被认为是一种潜在的植物源杀虫剂。本文综述了杠柳的杀虫抑菌活性、主要杀虫活性成分、作用机理以及制剂开发与应用,并结合笔者的工作,重点介绍了杠柳主要杀虫化合物杠柳新苷P在东方黏虫Mythimna separata幼虫中肠细胞膜上的作用靶标及其靶标验证方面的研究进展。最后,展望了杠柳作为商业化杀虫剂研究的未来发展趋势,以期为中国绿色农药创制提供参考。

地果地上部分抑菌活性研究

采用孢子萌发法和菌丝生长法测定地果地上组织甲醇提取物对黄瓜霜霉病菌和马铃薯晚疫病菌的抑菌活性,提取物对2种供试病菌的孢子囊萌发,对马铃薯晚疫病菌菌丝生长均具有强烈的抑制作用,浓度为1000μg/mL时,抑制率均达到90%。盆栽试验和田间药效试验结果表明,10%的地果提取液稀释100倍对黄瓜霜霉病菌和马铃薯晚疫病菌的盆栽防效分别为85.89%和93.82%,对黄瓜霜霉病的防效为76.76%。

天葵子化学成分及抑菌活性研究

为探究天葵子化学成分及其抑菌活性。采用色谱法从天葵子中分离得到13个化合物,利用波谱学等方法鉴定了它们的化学结构,分别鉴定为蝙蝠葛内酯(1)、格列风内酯(2)、β-谷甾醇(3)、胡萝卜苷(4)、对羟基苯乙醇(5)、邻苯二甲酸-二-2-乙基-己酯(6)、小檗碱(7)、木兰碱(8)、唐松草酚定(9)、果糖(10)、紫草氰苷(11)、小檗红碱(12)、bauhinin(13)。其中化合物12和13为首次从天葵子中分离得到。采用滤纸片琼脂扩散法测定了所得化合物的抑菌活性,其中化合物7和12具有明显的抑菌活性,在载药量为5μg/片时,化合物7对白菜软腐病菌和猕猴桃溃疡病菌的抑菌圈直径分别为19.4、13.3mm;化合物12对青枯病菌和猕猴桃溃疡病菌的抑菌圈直径分别为13.2、12.8mm,表明天葵子对于防治作物细菌性病害具有较好的应用前景。

臭椿酮对植物种子萌发及相关生理生化指标的影响

臭椿酮是一种分布于臭椿中的苦木苦味素类化合物,具有广谱的除草活性。本研究测定了臭椿酮对多种植物种子萌发的抑制作用,及对活性氧(ROS)释放、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及过氧化物酶(POD)等相关生理生化指标及植物细胞有丝分裂的影响,以期为进一步研究臭椿酮的除草作用机制提供参考。结果表明:臭椿酮对油菜Brassica napus、稗草Echinochloa crusgalli、苘麻Abutilon theophrasti、狗尾草Setaria viridis和马唐Digitaria sanguinalis种子萌发具有较强的抑制作用,其IC_(50)值分别为3.74、9.86、9.71、3.87和3.76μg/mL;臭椿酮对种子吸水能力无明显影响;在1.00μg/mL质量浓度下,臭椿酮对植物根尖分裂有较强的抑制作用,有丝分裂指数为0.48%(清水对照组为5.85%),并可引起细胞分裂畸形;SOD、CAT与POD酶活性测定结果表明,臭椿酮可以提高植物的抗氧化能力;活性氧染色结果证明,0.10μg/mL的臭椿酮就可以诱导活性氧的爆发;细胞死亡率测定结果表明,臭椿酮的存在可导致一定比例的细胞失去活性。本研究表明,臭椿酮可通过多种方式抑制植物种子生长,既能有效抑制植物细胞分裂,又可诱导植物体内活性氧的积累。

果蝇钠通道DmNav22在双氧木脂素A作用机理研究中的应用

建立以爪蟾卵母细胞为载体的果蝇钠通道表达系统,研究双氧木脂素A的杀虫分子机理。将果蝇钠通道DmNav22与TipE亚基基因分别进行体外转录,获得DmNav22与TipE亚基基因的cRNA,将DmNav22与TipE的cRNA等质量混合,显微注射至新鲜的非洲爪蟾卵母细胞,在ND96溶液、18℃培养12~18h后采用双电极电压钳技术记录其电流,测定双氧木脂素A对钠电流的影响。结果表明,注射cRNA的非洲爪蟾卵母细胞,可记录到明显的果蝇钠通道电压门控内向电流,未注射的对照组细胞则未记录到钠电流;双氧木脂素A使钠通道失活电压依赖性向超极化方向移动。说明,果蝇钠通道在非洲爪蟾卵母细胞中成功表达,为进一步研究双氧木脂素A的作用机理奠定基础。

河朔荛花根中抑菌活性成分研究

在活性追踪指导下,采用多种分离技术从河朔荛花根甲醇提取物中分离得到12个化合物,经核磁共振波谱、质谱等技术并结合相关文献确定其结构分别为1-己酸-2,3-硬脂酸甘油三酯(1)、β-谷甾醇(2)、月桂醇(3)、顺-十八碳-9-烯酸(4)、(2E)-庚基-3-(3, 4-二羟基苯基)丙烯酸酯(5)、(–)-pluviatolide(6)、1β-hydroxy-10β-H-guaia-4,11-dien-3-one(7)、异狼毒素(8)、新狼毒素B(9)、瑞香酚(10)、单棕榈酸甘油酯(11)和(+)-去甲络石甙元(12)。其中,化合物3、4和6～12均为首次从河朔荛花中分离得到。抑菌活性测定结果表明:异狼毒素(8)和新狼毒素B(9)对马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans菌丝生长和孢子萌发均表现出明显的抑制作用,其中对菌丝生长的EC50值分别为68.4μg/mL和44.9μg/mL,对孢子萌发的EC50值分别为25.1μg/mL和14.0μg/mL。

我国水稻稻瘟病菌对三环唑抗性研究现状

三环唑是我国大面积防治水稻稻瘟病的主要药剂。近年来,随着三环唑田间防效降低报道的增多,三环唑的抗性发生发展情况倍受关注。本文全面阐述了三环唑在我国的登记情况以及抗性研究现状。

新烟碱类杀虫剂吡虫啉的抗性研究进展

吡虫啉因其选择性高、杀虫谱广近年来已经成为全球发展最为迅速的农药之一。在我国推广使用20余年,吡虫啉的抗性风险已经越来越受到重视。本文论述了吡虫啉在多种作物上的抗性发展情况,为延缓吡虫啉的使用寿命以及其抗性监测及抗性治理提供一定参考。

反枝苋活性成分的提取及其对提高小麦抗高温胁迫的作用

反枝苋提取物能够显著增强小麦植株的抗高温胁迫能力,但其中起作用的活性成分尚不清楚。本研究采用生物活性追踪法,从反枝苋根部分离到5个化合物,经核磁共振波谱及质谱分析分别被鉴定为对羟基苯甲酸(1)、14-羟基肉豆蔻酸(2)、对甲氧基苯甲酸(3)、3-(羟乙酰基)吲哚(4)和3-吲哚甲醛(5)。对羟基苯甲酸、对甲氧基苯甲酸和14-羟基肉豆蔻酸均能增强小麦对高温胁迫的耐受性,其中对甲氧基苯甲酸效果最突出,在100μg/mL剂量下,与空白对照相比,小麦植株鲜重增加了56.44%,茎叶长度增加了30.03%,根长增加了38.71%。经50μg/mL对甲氧基苯甲酸处理小麦幼苗后,分别于40℃高温胁迫1、3、5和7 d,取样测定植株体内相关生理生化指标的变化。结果表明:高温胁迫1、3、5、7 d后,与空白对照相比,小麦植株体内丙二醛含量分别降低了32.59%、50.27%、57.53%、33.64%;脯氨酸含量在1、3和5 d分别增加了28.57%、50.00%、29.87%,第7天降低了5.16%;可溶性糖含量分别增加了39.76%、35.93%、41.33%、12.50%;超氧化物岐化酶活性分别增加了39.48%、41.63%、26.09%、25.27%,过氧化物酶活性分别增加了11.19%、32.05%、32.54%和26.90%,过氧化氢酶活性分别增加了35.62%、50.97%、22.82%和25.89%。综上,对甲氧基苯甲酸可显著提高小麦抗高温胁迫的能力。

东方粘虫中肠V-ATP酶a亚基的克隆及原核表达

对东方粘虫[Mythimna separata(Walker)]中肠V-ATPase a亚基(MS-VATPa)cDNA全长序列进行克隆、原核表达及纯化研究。采用RT-PCR和RACE技术克隆MS-VATPa基因,再亚克隆于原核表达载体pET-22b(+)以构建重组载体pET22b-MS-VATPa,将鉴定正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,采用Ni-NTA柱亲和层析法纯化目标蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot验证。结果表明:成功克隆东方粘虫中肠MS-VATPa基因的cDNA全长序列,并实现MS-VATPa基因在大肠杆菌原核表达系统中的可溶性表达。

Cylindrocarpon olidum W1菌株代谢物中壳二孢氯素及其类似物的分离及抑菌活性

采用硅胶柱层析及高效液相色谱等技术从冬青卫矛内生真菌Cylindrocarpon olidum W1次生代谢物中分离鉴定出8个抑菌活性化合物W1-1~W1-8。经核磁共振氢谱和碳谱、高分辨质谱等技术,并结合相关文献确认其为壳二孢氯素及其类似物,分别为Ilicicolin A(W1-1)、5-Chlorocolletorin B(W1-2)、Ilicicolin B(W1-3)、Deacetylchloronectrin(W1-4)、Ilicicolin C(W1-5)、壳二孢氯素(W1-6)、Cylindrol A_4(W1-7)和Cylindrol B(W1-8)。抑菌活性测定结果表明:壳二孢氯素及其类似物对烟草青枯病菌有较强的抑制作用,上述化合物的最小抑制浓度分别为6.2 5、3.1 3、>1 0 0、3.1 3、6.2 5、1 2.5、2 5和2 5μg/m L;化合物W 1-2、W1-4和W1-5对番茄灰霉病菌和油菜菌核病菌菌丝生长亦有较强的抑制作用,其中对番茄灰霉病菌的抑制中浓度(IC_(50))分别为36.45、21.60和26.69μg/m L,对油菜菌核病菌的抑制中浓度分别为20.21、16.79和12.11μg/m L。

除草剂NWAFU-J10创制经纬

以除草剂苯噻酰草胺、草除灵、苯噻隆和噻唑禾草灵中共有的苯并噻唑为起始原料,基于非活性基团多样化衍生策略,通过苯并噻唑3-位引入取代苯基和吡啶基构建化合物库。采用小杯法评价了所合成化合物对稗草和马齿苋的除草活性,发现先导化合物3-(3-氯-5-三氟甲基吡啶-2-基)苯并噻唑2-酮(化合物99)。再先导优化,最终获得具有3-吡啶基苯并噻唑-2-酮新颖分子骨架的高除草活性候选化合物NWAFU-J10。NWAFU-J10合成工艺简便、生产成本较低,对大多阔叶杂草表现出极高除草活性,具有良好产业化开发前景。

扁茎黄芪植株中化学成分的分离鉴定及其抑菌活性

为综合开发利用药用植物扁茎黄芪Astragalus complanatus,对其非药用部位的化学成分及抑菌活性进行了初步研究。采用硅胶柱层析和LH-20凝胶层析技术从扁茎黄芪植株中分离鉴定了7个化合物,并测定了各化合物对8种细菌的抑菌活性。根据波谱分析结果,7个化合物分别被鉴定为β-谷甾醇(1)、β-sitostenone (2)、lawsaritol A (3)、3β-羟基-5α,8α-桥二氧麦角甾-6,22-二烯(4)、3′,7-二羟基-2′,4′-二甲氧基异黄烷(5)、D-1-O-甲基肌醇(6)和沙苑子苷(7),所有化合物均为首次从扁茎黄芪植株中分离得到。抑菌活性测定结果表明:化合物5对蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus、大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、白菜软腐病菌Erwinia carotovora、猕猴桃溃疡病菌Pseudomonas syringaepv.actinidiae和烟草青枯病菌Ralstonia solanacearum均有不同程度的抑制作用,其中对猕猴桃溃疡病菌、烟草青枯病菌和白菜软腐病菌的最低抑制浓度(MIC)分别为37.5、18.8和75.0μg/mL。3′,7-二羟基-2′,4′-二甲氧基异黄烷(5)的农用抑菌活性为首次报道。

辣椒碱类似物的合成及杀虫活性

基于辣椒碱结构,以取代苄胺为原料,经N-酰化反应合成了6个系列204个辣椒碱类似物,其中8个为新化合物。通过核磁共振氢谱(1H NMR)对化合物的结构进行了确证。采用叶碟法测定了目标化合物的杀虫活性。结果表明:大部分化合物在10μg/片下对供试的3龄东方黏虫Mythimna separata有较强的毒杀活性,其中化合物A30、D20、D30、D35、E30和F3048 h的致死率达100%,化合物D19、D21、D22、D23、D31和E3148 h的致死率在90%以上。初步构效关系表明,苄胺苯环上氟原子单取代衍生物的杀虫活性优于氟原子双取代衍生物,其中以2-氟苄胺衍生物(D系列)杀虫活性较好;此外,酰基为2-噻吩甲酰时的杀虫活性明显优于其他取代基,表明酰基对该类化合物的杀虫活性也有显著影响。

杀虫活性化合物杠柳新苷P对东方粘虫中肠细胞上结合蛋白的影响

杠柳新苷P是从杠柳根皮提取物中分离得到的一种甾体糖苷类化合物,对东方粘虫表现出较好的杀虫活性。为了进一步研究其杀虫机理,探究杠柳新苷P作用于东方粘虫中肠疑似作用位点,通过对杠柳新苷P进行结构修饰,与东方粘虫幼虫中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)组织体外孵育,利用其结构修饰后增强的紫外吸收特性,经蛋白分离、纯化,进而得到杠柳新苷P作用于粘虫中肠BBMV上的结合蛋白。结果表明:在粘虫中肠BBMV上存在杠柳新苷P的疑似结合蛋白,且经分离鉴定得到5种疑似结合蛋白,分别为类异翅盘蛋白、氨肽酶、二硫键异构酶、苯基贮存蛋白以及精氨酸激酶;通过进一步的分析推测,氨肽酶可能是杠柳新苷P作用于东方粘虫幼虫中肠BBMV上的结合蛋白。初步明确杠柳新苷P作用于东方粘虫中肠的疑似作用位点,但仍需进一步的验证工作进行确认,为今后研究杠柳新苷类化合物的作用机理及靶标提供依据。

杠柳新苷P和E对粘虫和小地老虎中肠3种解毒酶的影响

为进一步探讨杠柳新苷类化合物在昆虫体内的代谢机制。比较研究高活性杠柳新苷P(Periploca sepium P,PSP)和无杀虫活性的杠柳新苷E(Periploca sepium E,PSE)对6龄粘虫幼虫(Mythimna separata)与小地老虎幼虫(Agrotis ypsilon)中肠3种代谢酶[羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、细胞色素P450-O-脱甲基酶]活性的影响。结果表明:药后8h,PSP和PSE使粘虫幼虫GST活性增加,但PSP上升趋势比PSE更高。而2种化合物对试虫CarE活性均无明显影响。药后12h,PSP和PSE使粘虫中肠细胞色素P450-O-脱甲基酶酶比活力显著下降,而小地老虎中该酶活性无明显变化。因此,可推测GST可能参与昆虫对杠柳毒素的解毒作用,而细胞色素P450-O-脱甲基酶活性被杠柳毒素抑制可能是造成粘虫中毒的机制之一。

杠柳新苷P在水和土壤中的降解与移动特性

采用室内模拟试验,研究植物杀虫活性成分杠柳新苷P在不同水体和不同类型土壤中的降解与移动特性,分析其对不同水体与不同类型土壤的污染风险性。结果表明:温度和pH对杠柳新苷P在水中的降解均有一定程度的影响。温度为50℃、pH=9时,降解速率最快,其水解半衰期为2.36d。土壤降解与土壤淋溶试验表明,杠柳新苷P在麦田土、果园土和菜园土中的降解半衰期分别为4.33、4.25和3.85d,降解速率依次为菜园土>果园土>麦田土;对比试验研究表明,在未灭菌的土壤中,杠柳新苷P的降解速率比灭菌的土壤中显著加快。

三氟羧草醚类似物的合成及除草活性

以2,5-二羟基苯甲酸甲酯和三氟羧草醚为起始原料,设计合成了3个系列20个新的三氟羧草醚类似物,通过核磁共振氢谱、碳谱对其结构进行了表征。分别采用小杯法和室内盆栽法测定了目标化合物的除草活性。结果表明,化合物III-02[5-(2-氯-4-三氟甲基苯氧基)-2-硝基苯甲酸-(6-甲基苯并噻唑-2-基)酯]对单子叶杂草的除草活性明显高于对照药剂三氟羧草醚,其对稗草Echinochloa crusgalli和马唐Digitaria sanguinalis根茎生长的EC_(50)值分别为2.03、0.93μg/mL和1.49、0.52μg/mL;在有效成分100 g/hm^(2)的施药剂量下,化合物III-02对单子叶杂草稗草、马唐及狗尾草Setaria viridis的防治效果均在85%以上,明显高于三氟羧草醚,对阔叶杂草马齿苋Portulaca oleracea、反枝苋Amaranthus retroflexus及苘麻Abutilon theophrasti的防治效果可达100%。初步构效关系表明,2-硝基苯甲酰衍生物的除草活性明显优于其2-甲氧基衍生物,三氟羧草醚苯甲酸酯衍生物对单子叶杂草的除草活性明显高于其苯甲酰胺衍生物。

大蓟地上组织化学成分及其抗真菌活性

为筛选新型植物源杀菌剂,对大蓟Cirsium japonicum地上组织的化学成分及其抑菌活性进行了系统研究。采用甲醇提取,液-液萃取分离、硅胶柱层析及凝胶层析等技术从乙酸乙酯相中分离得到13个化合物。利用质谱和核磁共振等波谱技术确定其结构分别为ciryneol D（1）、12β,20（S）-二羟基达玛烷-24-烯-3-酮（2）、3β-羟基-9（11）,12-齐墩果二烯（3）、蒲公英甾醇（4）、3β-羟基豆甾-5-烯-7-酮（5）、3β-羟基-12（13）-烯-齐墩果烷-11-酮（6）、对香豆酸（7）、（3-甲氧基酰氨基-4-甲基苯）-氨基甲酸甲酯（8）、对羟基苯甲酸酯（9）、4,4′-甲氧羰基氨基二苯甲烷（10）、槲皮苷（11）、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（12）和柯伊利素-7-O-2′-O-6′-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷（13）,其中,化合物2、3、6、8、10、12和13均为首次从大蓟中分离得到。生物测定结果表明：ciryneol D（1）对多种真菌菌丝生长表现出明显抑制作用,其中对苹果腐烂病原菌Valsa mali的抑制效果最好,EC50值为23.2μg/mL,对玉米弯孢病菌Curvularia lunata、苹果炭疽病菌Colletotrichum gloesporioides及番茄灰霉病菌Botrytis cinerea的孢子萌发也具有明显的抑制作用,EC50值分别为27.5、26.4和81.9μg/mL。

杠柳新苷类化合物对东方黏虫的杀虫活性及对中肠细胞刷状缘膜囊泡3种特征酶活性的影响

为了研究和阐明杠柳新苷类杀虫活性化合物对东方黏虫的杀虫活性及作用靶标,采用载毒叶片饲喂法测定比较了6个杠柳新苷类化合物(PSA、PSD、PSE、PSF、PSP和PST)对3龄东方黏虫Mythimna separata Walker幼虫的毒力;应用MgCl_(2)沉淀差速离心法制备东方黏虫中肠细胞刷状缘膜囊泡(BBMV)基础上,测定了6个化合物对东方黏虫幼虫中肠细胞BBMV中3种特征酶——氨肽酶、碱性磷酸酶及V-ATP酶活性的影响。结果表明:杠柳新苷P(PSP)和T(PST)对3龄东方黏虫幼虫表现出较高的杀虫活性,其24 h的致死中浓度(LC_(50)值)分别为1.60和1.23 mg/mL,杠柳新苷A(PSA)、D(PSD)和F(PSF)仅表现出微弱的杀虫活性(LC_(50)>20 mg/mL),而杠柳新苷E(PSE)则无明显杀虫活性。酶活性测定结果表明,6个杠柳新苷类化合物对氨肽酶和碱性磷酸酶活性均没有明显的抑制作用,而高杀虫活性化合物PSP和PST则可浓度依赖地抑制V-ATP酶活性。推测杠柳新苷类杀虫活性化合物的作用靶标与VATP酶有密切关系。